【摘要】：豆粕是大豆提取豆油后的一種副產(chǎn)品,其蛋白質(zhì)含量高達(dá)43%~46%,并且富含異黃酮、磷脂等生物活性物質(zhì)以及脂肪、糖類、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,是一種非常優(yōu)質(zhì)的畜禽植物蛋白飼料原料。但由于豆粕中含有抗原蛋白,會(huì)引起幼齡動(dòng)物發(fā)生過敏反應(yīng),癥狀表現(xiàn)為腹瀉、腸道炎以及生長(zhǎng)停滯等,甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡,在一定程度上限制了其在幼畜飼料中的應(yīng)用,因此降低豆粕中的抗原蛋白活性是近年來國(guó)內(nèi)外動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前,發(fā)酵豆粕和酶解豆粕以其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、富含活性成分、生產(chǎn)成本低且安全無污染的特性正越來越受到青睞。本論文擬通過將微生物發(fā)酵和蛋白酶水解相結(jié)合的方法,探尋一種低抗原豆粕的加工方法。本論文主要分為三個(gè)部分:(1)通過SDS-PAGE、水解度、ELISA等指標(biāo)篩選出降解抗原蛋白效果最佳的益生菌;(2)通過SDS-PAGE、水解度、ELISA等指標(biāo)篩選出降解抗原蛋白效果最佳的蛋白酶;(3)通過響應(yīng)面法確定菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的最佳條件。其主要的研究方法及結(jié)論如下:(1)采用不同的提取方法提取豆粕中的蛋白質(zhì),以發(fā)酵豆粕中蛋白質(zhì)電泳條帶完整性為篩選指標(biāo),選出較好的蛋白質(zhì)提取方法為:稱取磷酸二氫鉀(KH_2PO_4·2H_2O)1.2g、磷酸氫二鈉(Na_2HPO_4·12H_2O)14.5g,用蒸餾水溶解并定容至1000mL,取定容后的溶液100mL,加入48g尿素、0.31gDTT溶解后制成變性提取緩沖液,在80℃預(yù)熱5min,取6mL向其中加入1g豆粕,超聲提取60min,離心,取上清液,在截留分子量3500Da的透析袋中透析過夜,收集蛋白。(2)采用植物乳桿菌、干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和米曲霉發(fā)酵豆粕,根據(jù)料水比的不同分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。通過SDS-PAGE電泳分析蛋白條帶、OPA法測(cè)定確定豆粕蛋白水解程度、水解物中大豆抗原蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)定量檢測(cè)和ELISA檢測(cè)這兩種抗原蛋白的抗原性變化。結(jié)果表明,最佳的發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌,發(fā)酵條件為料液比1:1,菌接種量為1mL 1×10~8cfu/mL菌液,37℃發(fā)酵12h。此時(shí)豆粕的水解度為3.88%,豆粕中的大豆球蛋白的降解率為82.4%,β-伴大豆球蛋白的降解率為88.5%。經(jīng)總氨基酸含量測(cè)定,枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵12h后豆粕中的必需氨基酸含量約為194mg/g。(3)采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶水解豆粕,通過SDS-PAGE電泳分析蛋白條帶、OPA法確定豆粕蛋白水解程度、大豆抗原蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)定量檢測(cè)和ELISA檢測(cè)這兩種抗原蛋白的抗原性變化。結(jié)果表明,按照底物質(zhì)量的0.5%添加胃蛋白酶,在pH為2,37℃下水解60min為最佳反應(yīng)條件。此時(shí)豆粕的水解度為10.7%,豆粕中的大豆球蛋白降解率為79.3%,β-伴大豆球蛋白的降解率為87.6%。經(jīng)總氨基酸含量測(cè)定,胃蛋白酶水解60min后豆粕中的必需氨基酸含量約為170mg/g。(4)用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌和胃蛋白酶協(xié)同發(fā)酵制備低抗原性豆粕的條件,得到最佳的發(fā)酵條件為豆粕中添加0.825%豆粕質(zhì)量的胃蛋白酶,調(diào)整pH為2后,在37℃下酶解88.2min,此后,往培養(yǎng)基中接入1mL濃度為1×10~8cfu/mL單位不對(duì)的枯草芽孢桿菌,在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置發(fā)酵17.52h,此時(shí)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的降解率分別為78.6%和40.5%。
【圖文】：

大豆過敏反應(yīng)機(jī)制過敏反應(yīng)

2 豆粕經(jīng)不同菌種固態(tài)發(fā)酵 6h 后經(jīng) PBS 提取得到的蛋白提取液的 SDS-ig.3-2 SDS-PAGE diagram of protein extract obtained from soybean meal afterfermentation of different strains for 6h and PBS extraction 蛋白 marker；2 原豆粕；3-7 依次為植物乳桿菌、干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和米曲為植物乳桿菌、干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和米h 對(duì)水解豆粕中抗原蛋白條帶的電泳圖。通過五種菌發(fā)酵后蛋白的蛋白條帶對(duì)比可以看出，五種菌發(fā)酵后的蛋白跑道上基本看不明這五種菌在固態(tài)發(fā)酵 6h 后基本將豆粕中的大豆抗原蛋白水解 的短肽連。由于跑道顏色過深，可能只存很少一部分的堿性亞基條帶中看不出明顯的差異，，需結(jié)合水解度一起分析。140756045351 2 3 4 5 6 7
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ920.1;TS229

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本文編號(hào)：2608486