三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一,近年來,由于疾病頻發(fā)導(dǎo)致的大規(guī)模死亡事件,影響我國貝類養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Toll-樣受體在識別以及清除病原微生物中起重要作用,對TLR信號通路的研究有助于我們更好地了解三角帆蚌抗菌免疫機(jī)制,為貝類的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。搜索三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫得到TLR的EST序列并設(shè)計(jì)引物,運(yùn)用RACE-PCR方法獲得3種Toll-樣受體（以下分別簡稱HcTol18,9,10）的cDNA全長。結(jié)果顯示:HcToll8,9,10的cDNA全長分別為2538 bp;3692 bp和2612 bp,含有2139 bp,2157 bp和2355 bp的ORF,分別預(yù)測編碼712,719和784個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示,HcTo118,9,10的蛋白質(zhì)都包含一個(gè)N端信號肽,保守的結(jié)構(gòu)域LRRs和TIR及一段螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜域。多序列比對表明HcToll8,9分別與蝦夷扇貝（M.yessoensis）,海灣扇貝（A.irradians）的同源性最高,分別為31.38%和32.65%,HcToll 10與長牡... 

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 綜述
    1.1 引言
    1.2 貝類防御機(jī)制概述
        1.2.1 貝類免疫的模式識別機(jī)制
        1.2.2 病原相關(guān)分子模式(PAMP)
        1.2.3 模式識別受體(PRR)
    1.3 Toll-樣受體的研究進(jìn)展
        1.3.1 TLRs的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 TLRs的分子結(jié)構(gòu)
        1.3.3 TLRs的細(xì)胞定位
    1.4 TLRs的模式識別作用
        1.4.1 對細(xì)菌的識別
        1.4.2 對病毒核酸的識別
        1.4.3 對真菌多糖成分的識別
        1.4.4 對原生動物和寄生蟲的識別
        1.4.5 識別損傷相關(guān)或危險(xiǎn)相關(guān)模式分子
    1.5 TLR介導(dǎo)的天然免疫信號通路
    1.6 水生動物TLR研究進(jìn)展
    1.7 本研究目的及意義
第2章 三角帆蚌Toll-樣受體的鑒定及其免疫功能
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)動物
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株、載體及細(xì)胞
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.5 實(shí)驗(yàn)用引物信息
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 三角帆蚌總RNA的提取
        2.3.2 三角帆蚌cDNA的合成
        2.3.3 HcTLRs基因中間序列
        2.3.4 HcTLRs cDNA序列全長
        2.3.5 HcTLRs基因序列分析
        2.3.6 HcTLRs在蚌組織中的特異性表達(dá)
        2.3.7 蚌的刺激試驗(yàn)
        2.3.8 熒光實(shí)時(shí)定量PCR
        2.3.9 HcTLRs的原核表達(dá)及重組蛋白純化
        2.3.10 HcToll9多克隆抗體的制備及純化
        2.3.11 HcToll9多克隆抗體的檢測
        2.3.12 檢測HcToll9在各組織中的表達(dá)
        2.3.13 微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        2.3.14 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
        2.3.15 血細(xì)胞mRNA原位雜交
        2.3.16 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.17 亞細(xì)胞定位
        2.3.18 熒光素酶雙報(bào)告基因試驗(yàn)
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 提取總RNA
        2.4.2 HcToll8,9,10基因全長的克隆
        2.4.3 TLRs基因cDNA全長及推導(dǎo)的氨基酸序列
        2.4.4 氨基酸序列的同源性比對
        2.4.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
        2.4.6 HcTLRs基因的組織表達(dá)
        2.4.7 PAMP刺激三角帆蚌后TLRs的表達(dá)模式
        2.4.8 HcToll9和HcToll10原核表達(dá)和純化
        2.4.9 多克隆抗體及ELISA檢測
        2.4.10 HcToll9蛋白在蚌組織中的分布
        2.4.11 rHcToll-9,10-LRR與微生物的結(jié)合
        2.4.12 rHcToll-9,10-LRR與PAMP的結(jié)合
        2.4.13 血細(xì)胞mRNA原位雜交
        2.4.14 重組蛋白亞細(xì)胞定位
        2.4.15 熒光素酶雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
    2.5 討論
第3章 結(jié)論與展望
    3.1 結(jié)論
    3.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]我國貝類養(yǎng)殖管理現(xiàn)狀及建議[J]. 王靖陶,慕永通.  中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì). 2010(03)
[2]我國養(yǎng)殖貝類大規(guī)模死亡的原因分析及防治對策[J]. 張國范,李霞,薛真福.  中國水產(chǎn). 1999(09)

博士論文
[1]TLR4在創(chuàng)傷性腦損傷急性炎癥損傷中的作用機(jī)制及姜黃素的保護(hù)效應(yīng)研究[D]. 朱海濤.第三軍醫(yī)大學(xué) 2016



本文編號：3715695