青蝦,學(xué)名日本沼蝦（Macrobrachium nipponensis）,俗稱河蝦,是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種。2012年的養(yǎng)殖產(chǎn)量達到了237,431噸,年產(chǎn)值超過150億。青蝦的生長、發(fā)育以及交配繁殖都與蛻殼（蛻皮）緊密相關(guān)。幾丁質(zhì)酶是在甲殼動物蛻殼過程中起著重要的作用的幾種酶之一,與β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶聯(lián)合作用將幾丁質(zhì)聚合物水解成為幾丁質(zhì)單體,從而使舊的外殼脫落。除在蛻殼過程中發(fā)揮作用外,幾丁質(zhì)酶還具有多種生物學(xué)作用,如食物消化、圍食膜的降解、免疫反應(yīng)等。鑒于幾丁質(zhì)酶基因在甲殼動物中的作用,且在青蝦中至今沒有研究報道。因此,本文擬克隆出青蝦的幾丁質(zhì)酶家族基因,并將它們進行系統(tǒng)分類和命名。通過研究它們的分子特征、組織分布、胚后發(fā)育以及在蛻殼周期過程中的時空表達模式,結(jié)合不同溫度下各幾丁質(zhì)酶基因的表達情況,進而推斷出這些基因可能的生物學(xué)功能。本文從本實驗室構(gòu)建的青蝦精巢文庫中篩選到28條幾丁質(zhì)酶基因的EST序列,將這些EST序列拼接后獲得5個幾丁質(zhì)酶基因的中間序列,此外還通過同源克隆的方法獲得1個幾丁質(zhì)酶基因的中間序列。采用快速擴增cDNA末端（rapid-amplificatio... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    第一節(jié) 幾丁質(zhì)酶及甲殼動物蛻殼相關(guān)研究概況
        1 幾丁質(zhì)
            1.1 幾丁質(zhì)聚合物的結(jié)構(gòu)特征
                1.1.1 α型幾丁質(zhì)
                1.1.2 β型幾丁質(zhì)
                1.1.3 γ型幾丁質(zhì)
            1.2 幾丁質(zhì)在節(jié)肢動物中的分布特征
            1.3 幾丁質(zhì)的降解
        2 幾丁質(zhì)酶及其分類
            2.1 幾丁質(zhì)酶
            2.2 幾丁質(zhì)酶的分類
                2.2.1 基于幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性的分類
                2.2.2 基于水解后初級產(chǎn)物類型的分類
                2.2.3 基于幾丁質(zhì)酶活性的分類
        3 甲殼動物蛻殼及其調(diào)控的研究
            3.1 甲殼動物的蛻殼類型
                3.1.1 變態(tài)蛻殼
                3.1.2 生長蛻殼
                3.1.3 再生蛻殼
                3.1.4 生殖蛻殼
            3.2 甲殼動物的蛻殼周期
            3.3 影響甲殼動物蛻殼的環(huán)境因素
                3.3.1 溫度對甲殼動物蛻殼的影響
                3.3.2 鹽度對甲殼動物蛻殼的影響
                3.3.3 重金屬離子對甲殼動物蛻殼的影響
            3.4 甲殼動物蛻殼的調(diào)控
    第二節(jié) 幾丁質(zhì)酶基因的研究進展
        1 幾丁質(zhì)酶基因研究概況
            1.1 昆蟲幾丁質(zhì)酶基因
            1.2 甲殼動物幾丁質(zhì)酶基因
        2 幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征
            2.1 催化結(jié)構(gòu)域
            2.2 S/T富集的連接區(qū)
            2.3 幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域
        3 幾丁質(zhì)酶基因表達的調(diào)控
            3.1 幾丁質(zhì)酶基因的組織分布和表達模式
            3.2 幾丁質(zhì)酶基因的表達量和酶活性的周期性變化
            3.3 幾丁質(zhì)酶基因的表達受到激素的調(diào)控
        4 幾丁質(zhì)酶的功能研究
            4.1 在蛻殼反應(yīng)中的作用
            4.2 在免疫學(xué)中的作用
            4.3 在消化反應(yīng)中的作用
    第三節(jié) 本研究的目的與意義
第二章 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因的克隆及序列分析
    1 實驗材料
        1.1 實驗蝦
        1.2 試劑
        1.3 儀器
    2 實驗方法
        2.1 青蝦總RNA的提取
            2.1.1 實驗用品的預(yù)處理
            2.1.2 總RNA的提取
            2.1.3 DNase消化
            2.1.4 總RNA的濃度測定和質(zhì)量檢測
        2.2 cDNA合成
        2.3 青蝦幾丁質(zhì)酶基因中間片段的獲得及驗證
            2.3.1 中間片段的獲取
            2.3.2 中間片段的驗證
        2.4 RACE快速擴增
            2.4.1 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因3’端擴增
            2.4.2 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因的5’端擴增
        2.5 PCR產(chǎn)物的克隆
            2.5.1 PCR產(chǎn)物的回收
            2.5.2 連接
            2.5.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
            2.5.4 重組克隆的鑒定
            2.5.5 質(zhì)粒提取與測序
        2.6 序列拼接
        2.7 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因全長cDNA完整性驗證
        2.8 生物信息學(xué)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因中間片段序列
        3.2 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因3’端的分離
        3.3 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因5’端的分離
        3.4 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因全長cDNA序列結(jié)構(gòu)特征
        3.5 基因命名和系統(tǒng)進化分析
        3.6 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列比對
        3.7 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.8 青蝦六個幾丁質(zhì)酶氨基酸序列一致性比較
    4 討論
第三章 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因的時空表達特征以及溫度變化對表達的影響
    1 實驗材料
        1.1 實驗蝦
        1.2 主要試劑
        1.3 儀器
    2 實驗方法
        2.1 青蝦胚后發(fā)育樣品的采集
        2.2 青蝦組織表達樣品的采集
        2.3 青蝦蛻殼周期樣品的采集
        2.4 不同溫度樣品的采集
        2.5 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因時空表達的實時熒光定量PCR分析
            2.5.1 引物設(shè)計及檢驗
            2.5.2 總RNA的提取
            2.5.3 cDNA第一鏈的合成
            2.5.4 實時熒光定量PCR反應(yīng)
            2.5.5 實時熒光定量PCR分析
    3 結(jié)果
        3.1 青蝦各樣本總RNA的檢測
        3.2 熒光定量引物的驗證
        3.3 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因在成體不同組織中的表達
        3.4 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因在胚后發(fā)育期的表達
        3.5 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因在蛻殼周期的表達
        3.6 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因在不同溫度下的表達
    4 討論
        4.1 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因在成體不同組織的表達差異
        4.2 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因在不同發(fā)育時期的表達差異
        4.3 青蝦六個幾丁質(zhì)酶基因在蛻殼周期和溫度下的表達規(guī)律
全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
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【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3636078