遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda,簡稱E.tarda）感染宿主范圍很廣,是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原體。它能夠在巨噬細胞內(nèi)生存和繁殖,是其致病的關(guān)鍵。已有研究表明Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）是E.tarda的一個重要毒力因子,EseB、EseC和EseD是T3SS重要的轉(zhuǎn)位子蛋白,其中EseC和EseD可插入宿主細胞膜,EseB則為游離部分。當E.tarda與宿主細胞接觸后,EseB、EseC和EseD會迅速組成轉(zhuǎn)運復(fù)合物在宿主細胞膜鉆孔,可以將E.tarda的效應(yīng)蛋白輸入宿主細胞,影響E.tarda的胞內(nèi)生存。EseC已被初步證明可影響E.tarda的胞內(nèi)生存,但其具體機制不完全清楚。本文利用自殺質(zhì)粒pHM5構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒,運用同源重組原理,缺失Et.CD株的eseC基因,得到eseC缺失株,并用PCR鑒定。再用pACYC184質(zhì)粒構(gòu)建eseC基因的重組質(zhì)粒,電擊導(dǎo)入缺失株中,得到缺失菌株的互補菌株并鑒定。為了探索EseC是否影響E.tarda細胞毒性和感染的細胞凋亡,以不同的MOI野生株,eseC缺失株和互補株分別感染巨噬細胞后,采用CCK-8試劑盒檢測巨噬細胞的存活率。... 

【文章來源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＩＩＩ型分泌系統(tǒng)針狀結(jié)構(gòu)圖［３４】??３４

以Ｅｔ．ＣＤ株為模板，ＰＣＲ擴增ｅｓｅＣ－Ｆｌ片段，將其與ｐＧＭ－Ｔ?ｅａｓｙ載體連??接，轉(zhuǎn)化至尺ｃｏ／／ＤＨ５ｃｔ感受態(tài)細胞中，提取重組質(zhì)粒，將其命名為ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ??質(zhì)粒，大小為３７８６ｂｐ，并用Ｘｂａｌ和Ｂｇｌ?ＩＩ進行酶切和ＰＣＲ鑒定，結(jié)果如圖１－１，??從圖中可以看出５泳道和６泳道均出現(xiàn)了大小約７７１ｂｐ的條帶，與２泳道的??ｅｓｅＣ－Ｆｌ片段的大小相符，最后經(jīng)測序驗證后，確認ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ質(zhì)粒含ｅｓｅＣ－Ｆｌ??片段。??Ｍ?１?２?３?４?５?８??＿?—：潘［：??圖１－１質(zhì)粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的鑒定??Ｍ：?ＤＬ５０００?１：未酶切質(zhì)粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ?２：?ｅｓｅＣ－Ｆｌ?片段?３：質(zhì)粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ?的?Ｘｂａｌ?酶切?４：質(zhì)粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ??的Ｂｇｌ?ＩＩ酶切５：質(zhì)粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的Ｘｂａｌ和Ｂｇｌ?ＩＩ雙酶切?６：質(zhì)粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的ＰＣＲ鑒定??２．２?ｐＧＭ－Ｔ－?Ｆ２質(zhì)粒的鑒定??將上述獲得的ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ和ｅｓｅＣ－Ｆ２片段分別用Ｘｂａｌ和ＳｐｈＩ雙酶切，并用??回收試劑盒回收后，將兩個片段用Ｔ４連接酶連接，轉(zhuǎn)化入￡．ｃ＿ｏ／／ＤＨ５ａ感受態(tài)細??胞中，提取重組質(zhì)粒，將其命名為？〇１＾－仰２，大小約為４４９８５？，并采用８以１１??和ＳｐｈＩ酶切和ＰＣＲ鑒定，結(jié)果如圖１－２，?６泳道出現(xiàn)大小約為１４８３ｂｐ大小的條??帶（ｅｓｅＣ－Ｆｌ＋ｅｓｅＣ?－Ｆ２的片段大�。c目的條帶大小相符，且經(jīng)過ＰＣＲ鑒定后，??７泳道出現(xiàn)了大小約７７１ｂｐ的條帶

用Ｂｇｌ?ＩＩ和Ｓａｃ?Ｉ雙酶切并回收，并將其與Ｆ１Ｆ２片段連接，將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)??Ｅ．ｃｏ／／?ＳＭｌＯ＾ｐｉｒ）中，提取質(zhì)粒并將其命名為ｐＨＭ－ＦｌＦ２，并用Ｂｇｌ?ＩＩ和ＳｐｈＩ酶??切和ＰＣＲ鑒定，結(jié)果如圖１－３，４泳道出現(xiàn)了大小約為１４８３ｂｐ大小的條帶，艮Ｐ??為ｅｓｅＣ－Ｆ?１和ｅｓｅＣ－Ｆ２的連接片段，且經(jīng)過ＰＣＲ鑒定后，５泳道出現(xiàn)了大小約７７１ｂｐ??的條帶，６泳道出現(xiàn)了?７１２ｂｐ的條帶，最后經(jīng)測序驗證后，確認ｐＨＭ－ＦｌＦ２質(zhì)粒??含ｅｓｅＣ－Ｆ?１片段和ｅｓｅＣ－Ｆ２片段。??Ｍ?１?２?３?４?５?６??馨ｇ｜■碧！修暴■鑽鐵＿鐵戀?６４８４ｂｐ??——１４８３ｂｐ??１０００?Ｉ????７７１ｂｐ??７５０?，?ＴＭ￣７１１ｂ９??５００?ＢＣＪｋ?：：．：??圖１－３重組質(zhì)粒ｐＨＭ５－Ｆ的鑒定??２４??

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3524194