發(fā)布時間：2021-08-24 14:12

　　課題組前期克隆得到了三種泥蚶血紅蛋白亞基基因，并從mRNA表達(dá)上初步發(fā)現(xiàn)了泥蚶血紅蛋白參與了抗菌免疫反應(yīng)，本研究擬從蛋白水平上探索泥蚶血紅蛋白是否具有抗菌活性，進(jìn)一步研究泥蚶血紅蛋白抗菌功能及機(jī)制。本研究以基地養(yǎng)殖的泥蚶為試驗材料，采用凝膠排阻色譜將泥蚶血紅蛋白分離純化，由此獲得三種血紅蛋白，根據(jù)測定蛋白質(zhì)天然狀態(tài)下分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線推測這三種物質(zhì)分別為雜蛋白、異源四聚體、同源二聚體。Tricine-SDS-PAGE的電泳結(jié)果進(jìn)一步證明已經(jīng)分離純化出泥蚶的兩種血紅蛋白。將純化的兩種血紅蛋白采用胰蛋白酶酶解，并使用反相C-18柱進(jìn)行分離純化。通過瓊脂糖彌散法檢測兩種血紅蛋白及酶解多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌的抗菌活性。結(jié)果顯示泥蚶血紅蛋白對金黃色葡萄球菌和三種弧菌沒有抑菌活性，而泥蚶血紅蛋白酶解多肽只對副溶血弧菌、溶藻弧菌有抑菌活性。為進(jìn)一步定量抗菌活性，采用96孔板微量對倍稀釋法測定了泥蚶血紅蛋白純化樣品以及異源四聚體酶解多肽的最低抑菌濃度（MIC值），發(fā)現(xiàn)泥蚶血紅蛋白HbⅠ對大腸桿菌的MIC為0.125mg/mL，對枯草芽... 

【文章來源】：寧波大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

泥蚶血紅蛋白的SephacrylS-100凝膠過濾柱層析

過程中血紅素的丟失，這三個電泳條帶的分子量基本與理論分子量相符，由此進(jìn)一步確定凝膠層析出的第二個峰為異源四聚體 HbⅡ，第三個峰為同源二聚體 HbⅠ。圖2.2 泥蚶血紅蛋白樣品的Tricine-SDS-PAGE 電泳圖Fig.2.2 Tricine-SDS-PAGE of Tegillarca granosa hemoglobin preparations1 泥蚶血紅蛋白 Sephacryl S-100 峰 1；2 泥蚶血紅蛋白 Sephacryl S-100 峰 2；3 泥蚶血紅蛋白 Sephacryl S-100 峰 2；M：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白2.3.3 Tricine-SDS-PAGE 條帶的質(zhì)譜分析獲得泥蚶血紅蛋白純品后，再經(jīng)Tricine-SDS-PAGE 電泳，將條帶2 和3 進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖 2.3、圖2.4 所示，條帶2 的兩條鏈分別與不等殼毛蚶（Scapharcainaequivalvis）HB-ⅡA 和梯形毛蚶（Anadara trapezia ）血紅蛋白的 β 鏈最相似；而條帶3 與不等殼毛蚶的Hb Ⅰ（同源二聚體）最相似。因此鑒定結(jié)果為峰 2、峰3 分別為泥蚶血紅蛋白Ⅱ（異源四聚體）、泥蚶血紅蛋白Ⅰ（同源二聚體）。

泥蚶血紅蛋白及其多肽的抗菌功能和應(yīng)用研究20圖2.3 泥蚶Hb Tricine-SDS-PAGE 條帶2 的質(zhì)譜圖Fig.2.3 The mass spectrogram of Tricine-SDS-PAGE Band 2 from Tegillarcagranosa圖2.4 泥蚶Hb Tricine-SDS-PAGE 條帶3 的質(zhì)譜圖Fig.2.4 The mass spectrogram of Tricine-SDS-PAGE Band 2 from Tegillarcagranosa2.3.4 泥蚶血紅蛋白天然狀態(tài)分子量的確定三種標(biāo)準(zhǔn)蛋白經(jīng) Sephaeryl S-100 凝膠過濾柱層析后，得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫曲線，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，洗脫體積為縱坐標(biāo)，繪

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]厚殼貽貝血細(xì)胞及血清抗菌肽的分析[J]. 楊麗佳,武梅,王信超,李楠楠,楊林,陳銘杰,廖智.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2011(23)
[2]文蛤蛋白抗菌肽制備工藝優(yōu)化與抗菌活性研究[J]. 姚興存,邱春江.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(31)
[3]馬氏珠母貝鰓組織抗菌活性的研究[J]. 張英霞,鄒瑗徽,滿初日嘎,周永燦.  水產(chǎn)科學(xué). 2010(08)
[4]貽貝抗菌肽的研究進(jìn)展[J]. 于道德,寧璇璇,任貴如,官曙光,高翔,劉夢俠,李紹彬,關(guān)健,于發(fā)盛,劉洪軍.  海洋科學(xué). 2009(11)
[5]水產(chǎn)動物抗菌肽研究的最新進(jìn)展[J]. 張家國.  大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報. 2009(S1)
[6]天然抗菌肽的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J]. 吳甜甜,楊潔.  生物技術(shù)通報. 2009(01)
[7]人血紅蛋白及其片段體內(nèi)外抗菌活性研究[J]. 周新娥,歐陽運薇,潘小玲,何躍東,李恒,鄧璐霞,石艷娥,彭媛媛,趙媛,黃寧.  四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2008(03)
[8]泥蚶線粒體COI和16S rRNA基因片段序列研究[J]. 鄭文娟,朱世華,沈錫權(quán),葉央芳,潘志崇.  寧波大學(xué)學(xué)報(理工版). 2008(01)
[9]貝類免疫學(xué)研究新進(jìn)展[J]. 張朝霞,王軍,丁少雄,蘇永全.  廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2006(S2)
[10]扇貝多肽對紫外線輻照小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 閻春玲,張國梁,戰(zhàn)松梅,劉萬順,王躍軍,王春波.  中國海洋藥物. 2005(06)

博士論文
[1]毛蚶（Scapharca Kagoshimensis）血紅蛋白的類酚氧化酶性質(zhì)及其抗菌活性研究[D]. 荊昭.中國海洋大學(xué) 2011
[2]皺紋盤鮑和櫛孔扇貝抗菌肽的研究[D]. 洪旭光.中國海洋大學(xué) 2008



本文編號：3360140