補(bǔ)體激活過(guò)程中釋放的過(guò)敏性毒素C5a片段具有強(qiáng)烈的促炎反應(yīng),可以迅速激活多種炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫激活效果,具有作為疫苗分子佐劑的巨大潛力。本文以魚(yú)類(lèi)來(lái)源的過(guò)敏性毒素C5a作為候選分子佐劑,以魚(yú)類(lèi)重要細(xì)菌性病原遲鈍愛(ài)德華氏菌的細(xì)菌載體疫苗以及重組蛋白疫苗為考察對(duì)象,在斑馬魚(yú)模型上初步證明了C5a具有促進(jìn)疫苗免疫保護(hù)效果的作用,可作為分子佐劑進(jìn)行魚(yú)類(lèi)疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。為了開(kāi)發(fā)更為有效的魚(yú)類(lèi)DNA疫苗,我們對(duì)真核表達(dá)載體pcDNA3.1+進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì),將原有CMV啟動(dòng)子改造為添加了人T細(xì)胞白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR的CMV/R啟動(dòng)子,同時(shí)添加土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件WPRE,從而構(gòu)建了新的真核表達(dá)系統(tǒng)pc3.1-CW,上述表達(dá)系統(tǒng)具有顯著增強(qiáng)的表達(dá)效果。基于上述優(yōu)化過(guò)的真核表達(dá)系統(tǒng)pc3.1-CW,我們構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)遲鈍愛(ài)德華氏菌保護(hù)性抗原ETAE-1227和分子佐劑C5a的候選疫苗。基于斑馬魚(yú)模型的疫苗免疫保護(hù)效果及免疫因子分析表明：以C5a為分子佐劑,采用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和雙順?lè)醋颖磉_(dá)的方式所構(gòu)建的DNA疫苗既能激活細(xì)胞免疫又能激活體液免疫,均能產(chǎn)生60%以上的免疫保護(hù)效果... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性病害
    1.2 魚(yú)類(lèi)疫苗的發(fā)展及種類(lèi)
        1.2.1 滅活疫苗
        1.2.2 減毒活疫苗
        1.2.3 載體疫苗
        1.2.4 亞單位疫苗
        1.2.5 DNA疫苗
    1.3 分子佐劑
        1.3.1 分子佐劑的作用機(jī)制
        1.3.2 分子佐劑的分類(lèi)
        1.3.3 過(guò)敏性毒素C3a、C5a
        1.3.4 過(guò)敏性毒素C3a、C5a作為佐劑的研究
        1.3.5 魚(yú)類(lèi)過(guò)敏性毒素C5a研究進(jìn)展
    1.4 課題研究背景及意義
第2章 魚(yú)類(lèi)過(guò)敏性毒素C5a的基因克隆
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)用引物,質(zhì)粒和菌株
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 魚(yú)類(lèi)過(guò)敏性毒素C5a序列的推定
        2.3.2 斑馬魚(yú)C5a的基因克隆
        2.3.3 羅非魚(yú)及虹鱒C5a基因獲得
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.4.1 魚(yú)類(lèi)C5a序列的獲得
        2.4.2 斑馬魚(yú)C5a基因克隆
        2.4.3 羅非魚(yú)及虹鱒C5a的基因克隆
    2.5 本章小結(jié)
第3章 以過(guò)敏性毒素C5a為佐劑的重組蛋白疫苗及細(xì)菌載體疫苗構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)用材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)用菌株、質(zhì)粒、引物
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)用試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 抗原與佐劑表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 重組抗原及佐劑蛋白的表達(dá)純化
        3.3.3 載體疫苗體外誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)
        3.3.4 斑馬魚(yú)的免疫與攻毒
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.4.1 抗原GAPDH的表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)純化
        3.4.2 佐劑C5a的表達(dá)載體構(gòu)建
        3.4.3 佐劑與抗原融合蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建與蛋白純化
        3.4.4 載體疫苗蛋白表達(dá)檢測(cè)
        3.4.5 載體疫苗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)免疫保護(hù)力分析
    3.5 本章小結(jié)
第4章 以過(guò)敏性毒素C5a為佐劑的DNA疫苗開(kāi)發(fā)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)用菌株,質(zhì)粒及引物
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)用試劑
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 DNA疫苗的構(gòu)建
        4.3.2 斑馬魚(yú)的免疫與攻毒
        4.3.3 DNA疫苗免疫保護(hù)力的測(cè)定
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及討論
        4.4.1 DNA疫苗PNl-GAPDH-C5a/dArg C5a的構(gòu)建
        4.4.2 斑馬魚(yú)的免疫攻毒
    4.5 本章小結(jié)
第5章 以過(guò)敏性毒素C5a為佐劑的DNA疫苗優(yōu)化
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)用材料
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)用菌株,質(zhì)粒及引物
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)用試劑
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 單基因表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化
        5.3.2 雙基因表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化
        5.3.3 優(yōu)化系統(tǒng)在細(xì)胞模型上的評(píng)估
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        5.4.1 單基因表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化
        5.4.2 基因表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化
        5.4.3 表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)量檢測(cè)
        5.4.4 HEK293細(xì)胞及EPC細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染比例確定
        5.4.5 單基因表達(dá)系統(tǒng)評(píng)估
        5.4.6 雙基因表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞模型評(píng)估
    5.5 本章小結(jié)
第6章 候選疫苗的免疫效力評(píng)價(jià)
    6.1 前言
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 攜帶穿膜肽裂解系統(tǒng)的載體疫苗體外誘導(dǎo)表達(dá)及免疫劑量確定
        6.3.2 候選DNA疫苗免疫劑量的確定
        6.3.3 斑馬魚(yú)免疫與組織提取
        6.3.4 組織DNA目的基因擴(kuò)增檢測(cè)
        6.3.5 組織內(nèi)目的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
        6.3.6 免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)
        6.3.7 DNA疫苗免疫保護(hù)力的測(cè)定
    6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        6.4.1 攜帶裂解系統(tǒng)及穿膜肽的載體疫苗免疫保護(hù)力分析
        6.4.2 攜帶裂解系統(tǒng)及穿膜肽的載體疫苗免疫應(yīng)答過(guò)程中相關(guān)免疫因子分析
        6.4.3 DNA疫苗質(zhì)量檢測(cè)
        6.4.4 免疫后組織內(nèi)抗原基因1227的PCR檢測(cè)
        6.4.5 DNA疫苗給藥劑量的確定
        6.4.6 C5a佐劑配合DNA疫苗使用的免疫保護(hù)力分析
        6.4.7 DNA疫苗免疫應(yīng)答過(guò)程中相關(guān)免疫因子分析
    6.5 本章小結(jié)
第7章 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
    7.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3282987