大黃魚的過氧化物酶IV（Peroxiredoxin IV,Lyc-PrxIV）是一種N端帶有信號(hào)肽的典型2-半胱氨酸過氧化物酶,常分泌到細(xì)胞外,存在于血漿,在胞內(nèi)則存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在細(xì)胞中的作用主要有抗氧化,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo),參與細(xì)胞的增殖、分裂和周期進(jìn)程,促進(jìn)血紅素的代謝,并可作為分子伴侶參與細(xì)胞損傷后修復(fù)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。為了研究Lyc-PrxIV在體內(nèi)是否具有抗氧化功能,我們構(gòu)建了表達(dá)Lyc-PrxIV的重組質(zhì)粒pCMV-Lyc-PrxIV,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK-293T,利用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品中Lyc-PrxIV的表達(dá)情況,并通過測(cè)定細(xì)胞內(nèi)過氧化氫濃度來評(píng)價(jià)Lyc-PrxIV的體內(nèi)抗氧化作用。結(jié)果顯示,Lyc-PrxIV可在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-Lyc-PrxIV的HEK-293T細(xì)胞中表達(dá),且細(xì)胞中過氧化氫的濃度在轉(zhuǎn)染后6 h、12 h、24 h時(shí)明顯低于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pCMV細(xì)胞中的過氧化氫濃度（P<0.01）。表明Lyc-PrxIV在生物體內(nèi)可以分解過氧化氫,參與生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的調(diào)控。為了進(jìn)一步了解Lyc-Prx... 

【文章來源】：集美大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 大黃魚簡(jiǎn)介及其病害
        1.1.1 養(yǎng)殖魚類主要病害
    1.2 生物體的抗氧化系統(tǒng)
        1.2.1 超氧化物歧化酶
        1.2.2 過氧化氫酶
        1.2.3 硫氧還原蛋白
        1.2.4 谷胱甘肽系統(tǒng)
        1.2.5 過氧化物酶（Peroxiredoxin）家族
    1.3 酵母雙雜交
        1.3.1 酵母雙雜交概述
        1.3.2 酵母雙雜交作用原理
        1.3.3 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)
    1.4 免疫共沉淀技術(shù)
    1.5 啟動(dòng)子概述
    1.6 本論文研究的目的和意義
第2章 大黃魚過氧化物酶IV在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)與抗氧化活性測(cè)定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 酶類以及主要試劑
        2.1.4 主要引物合成
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
        2.1.6 常用培養(yǎng)基和溶液
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 高糖DMEM培養(yǎng)基的配制
        2.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)
        2.2.3 細(xì)胞凍存
        2.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.2.5 Trizol法提總RNA
        2.2.6 RNA中基因組DNA的消化去除
        2.2.7 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.2.8 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.9 制備大腸桿菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.10 連接反應(yīng)
        2.2.11 轉(zhuǎn)化及菌落PCR的篩選
        2.2.12 去內(nèi)毒素試劑盒抽提質(zhì)粒DNA
        2.2.13 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞
        2.2.14 細(xì)胞裂解
        2.2.15 Western blot
        2.2.16 重組蛋白Lyc-PrxIV在HEK-293T細(xì)胞中的抗氧化活性分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 大黃魚脾臟cDNA的制備及Lyc-PrxIV目的片段的PCR擴(kuò)增
        2.3.2 重組質(zhì)粒pCMV-Lyc-PrxIV的構(gòu)建
        2.3.3 Lyc-PrxIV在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)
        2.3.4 重組蛋白Lyc- PrxIV在HK-293T細(xì)胞中的抗氧化活性分析
    2.4 討論
第3章 大黃魚過氧化物酶IV互作蛋白篩選及驗(yàn)證
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 菌株和質(zhì)粒
        3.1.3 酶類以及主要試劑
        3.1.4 主要引物合成
        3.1.5 主要儀器設(shè)備
        3.1.6 常用培養(yǎng)基和溶液
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.3 誘餌質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化
        3.2.4 誘餌質(zhì)粒DNA在酵母菌株中自激活檢測(cè)
        3.2.5 酵母雙雜交文庫轉(zhuǎn)化和篩選
        3.2.6 X-gal顯色實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 酵母質(zhì)粒的提取
        3.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.9 細(xì)胞裂解
        3.2.10免疫共沉淀
        3.2.11 Western blot
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 誘餌質(zhì)粒的毒性及自激活檢測(cè)
        3.3.2 陽性克隆的篩選和鑒定
        3.3.3 免疫共沉淀
    3.4 討論
第4章 大黃魚過氧化物酶IV啟動(dòng)子活性分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.2 菌株、載體和細(xì)胞
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 引物合成
        4.1.5 主要儀器設(shè)備
        4.1.6 常用溶液和培養(yǎng)基
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 用Genome Walker試劑盒擴(kuò)增Lyc-PrxIV的 5’調(diào)控序列
        4.2.2 構(gòu)建含Lyc-PrxIV的 5’調(diào)控序列和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒
        4.2.3 Lyc-PrxIV的 5’調(diào)控序列的活性驗(yàn)證
        4.2.4 Lyc-PrxIV啟動(dòng)子的免疫刺激分析
        4.2.5 Lyc-PrxIV啟動(dòng)子的刪除截短活性分析
        4.2.6 數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 用Genome Walker試劑盒擴(kuò)增Lyc-PrxIV的 5’調(diào)控序列
        4.3.2 Lyc-PrxIV的 5’調(diào)控序列活性分析
        4.3.3 Lyc-PrxIV啟動(dòng)子對(duì)免疫刺激的響應(yīng)分析
        4.3.4 不同長(zhǎng)度Lyc-PrxIV啟動(dòng)子活性分析
    4.4 討論
第5章 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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