鯉春病毒血癥病毒（Spring Viremia of Carp Virus, SVCV）可感染多種鯉科魚類,引起出血和腹腔炎等癥狀,造成巨大的經(jīng)濟損失,但SVCV感染宿主的致病機理目前知之甚少。細胞自噬（Autophagy）是真核細胞包裹胞內需要降解成分運輸至溶酶體并降解以維持自身健康的過程。自噬在抗病原微生物感染等過程中有重要作用,但病毒也可通過其自身編碼的蛋白抑制細胞自噬,逃避自噬的清除作用。本研究圍繞SVCV感染與細胞自噬的關系及利用蛋白質組學分析SVCV感染宿主細胞后差異性蛋白,以期為解析SVCV的致病機制提供科學依據(jù)。主要內容如下：1. SVCV感染EPC細胞誘導細胞自噬的分子機制通過電鏡,激光共聚焦顯微鏡和免疫印跡方法觀察,發(fā)現(xiàn)SVCV感染鯉上皮瘤細胞（EPC）后可以誘導細胞自噬,進一步研究發(fā)現(xiàn)SVCV的糖蛋白（G）在誘導細胞自噬中發(fā)揮重要作用。在此基礎上,通過熒光定量PCR,免疫印跡和病毒滴度測定分析抑制或激活細胞自噬后病毒滴度和mRNA的變化,我們發(fā)現(xiàn)自噬對SVCV的復制及病毒粒子的釋放具有促進作用,且該作用是通過及時清除受損的線粒體延長細胞存活時間實現(xiàn)的。進一步分析發(fā)... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻綜述
    1.1 鯉春病毒血癥病毒研究進展
        1.1.1 SVC流行特點
        1.1.2 SVCV生物學特性
        1.1.3 SVCV基因組結構
        1.1.4 SVCV的結構蛋白
            1.1.4.1 核蛋白
            1.1.4.2 基質蛋白
            1.1.4.3 糖蛋白
            1.1.4.4 磷蛋白
            1.1.4.5 病毒依賴性RNA聚合酶蛋白
    1.2 細胞自噬研究概論
        1.2.1 細胞自噬的種類及過程
        1.2.2 細胞自噬的分子機理
        1.2.3 細胞自噬的信號通路調節(jié)
        1.2.4 細胞自噬的常用研究方法
            1.2.4.1 掃描透射電鏡觀察
            1.2.4.2 免疫熒光技術
            1.2.4.3 Western blot檢測細胞自噬標記蛋白LC3的表型變化
            1.2.4.4 長壽蛋白的降解
            1.2.4.5 p62的降解
        1.2.5 細胞自噬與病毒感染的研究進展
        1.2.6 細胞自噬與機體免疫研究進展
    1.3 蛋白質組學方法及研究現(xiàn)狀
2 研究目的及意義
3 SVCV誘導細胞自噬的發(fā)生和分子機理
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 細胞、毒株
        3.2.2 載體與質粒
        3.2.3 引物序列及siRNA
        3.2.4 主要試劑
        3.2.5 培養(yǎng)基與抗生素及其配制
        3.2.6 主要實驗儀器及設備
        3.2.7 分子生物學分析軟件
    3.3 實驗方法
        3.3.1 表達質粒的構建
        3.3.2 Western blot實驗
            3.3.2.1 樣品制備
            3.3.2.2 SDS-PAGE電泳
            3.3.2.3 Western Blot檢測分析
        3.3.3 siRNA及質粒轉染
        3.3.4 間接免疫熒光實驗
        3.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀測
        3.3.6 MTT法檢測細胞活性
        3.3.7 透射電鏡觀察
        3.3.8 熒光定量PCR分析
        3.3.9 細胞培養(yǎng)與病毒滴度測定
        3.3.10 紫外滅活病毒的制備
        3.3.11 統(tǒng)計學方法
    3.4 實驗結果
        3.4.1 SVCV感染EPC細胞誘導細胞自噬
            3.4.1.1 EGFP-LC3融合表達質粒的構建
            3.4.1.2 掃描透射電鏡觀察SVCV感染細胞后形成自噬泡結構
            3.4.1.3 SVCV感染EPC細胞有自噬小體的點狀聚集
            3.4.1.4 SVCV感染EPC細胞后LC3的表達變化
        3.4.2 細胞自噬促進SVCV的增殖
            3.4.2.1. 自噬抑制劑和自噬誘導劑對細胞毒性的影響
            3.4.2.2 細胞自噬對SVCV mRNA復制的影響
            3.4.2.3 細胞自噬對SVCV粒子釋放的影響
            3.4.2.4 干擾LC3和Beclin-1基因表達抑制SVCV復制和釋放
            3.4.2.5 細胞自噬對SVCV入侵的作用
        3.4.3 SVCV誘導EPC細胞自噬機理的探討
            3.4.3.1 SVCV入侵可以誘導細胞自噬
            3.4.3.2 SVCV/G可以誘導細胞自噬
            3.4.3.3 mTOR蛋白在SVCV誘導細胞自噬中的作用
            3.4.3.4 ERK蛋白在SVCV誘導細胞自噬中的作用
            3.4.3.5 SVCV通過激活ERK蛋白抑制mTOR蛋白誘導細胞自噬
        3.4.4 細胞自噬促進病毒復制機理的初步探討
            3.4.4.1 細胞自噬通過延長被感染細胞的存活時間促進病毒復制
            3.4.4.2 細胞自噬可以清除細胞內受損的線粒體
    3.5 討論與結論
        3.5.1 討論
            3.5.1.1 SVCV感染宿主細胞產生完全細胞自噬
            3.5.1.2 細胞自噬促進SVCV的增殖
            3.5.1.3 mTOR-RK途徑參與SVCV誘導細胞自噬進程
        3.5.2 結論
4 SVCV感染宿主細胞的蛋白質組學分析
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 細胞、毒株
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 實驗儀器
        4.2.4 生物信息學分析軟件
    4.3 實驗方法
        4.3.1 細胞總蛋白質的制備
        4.3.2 雙向凝膠電泳
            4.3.2.1 第一向固相pH梯度等電聚焦
            4.3.2.2 第二向SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳
            4.3.2.3 凝膠染色
            4.3.2.4 雙向凝膠電泳圖像掃描及圖像分析
        4.3.3 制備質譜樣品
        4.3.4 MALDI-TOF-MS質譜分析及質譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫搜尋
        4.3.5 差異蛋白質的生物信息學分析
        4.3.6 Western blot分析
        4.3.7 實時熒光定量分析
    4.4 實驗結果
        4.4.1 雙向電泳和質譜鑒定的差異蛋白分析
        4.4.2 實時熒光定量PCR驗證SVCV感染的差異性蛋白
        4.4.3 Western blot驗證SVCV感染的差異性蛋白
    4.5 討論與結論
        4.5.1 SVCV感染導致細胞骨架相關蛋白的改變
        4.5.2 SVCV感染導致泛素蛋白酶體途徑（UPP）相關蛋白的改變
        4.5.3 SVCV感染導致信號通路相關蛋白的改變
        4.5.4 SVCV感染導致生物代謝相關蛋白的改變
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3154642