鯉春病毒血癥病毒（Spring Viremia of Carp Virus, SVCV）可感染多種鯉科魚(yú)類(lèi),引起出血和腹腔炎等癥狀,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,但SVCV感染宿主的致病機(jī)理目前知之甚少。細(xì)胞自噬（Autophagy）是真核細(xì)胞包裹胞內(nèi)需要降解成分運(yùn)輸至溶酶體并降解以維持自身健康的過(guò)程。自噬在抗病原微生物感染等過(guò)程中有重要作用,但病毒也可通過(guò)其自身編碼的蛋白抑制細(xì)胞自噬,逃避自噬的清除作用。本研究圍繞SVCV感染與細(xì)胞自噬的關(guān)系及利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析SVCV感染宿主細(xì)胞后差異性蛋白,以期為解析SVCV的致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。主要內(nèi)容如下：1. SVCV感染EPC細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制通過(guò)電鏡,激光共聚焦顯微鏡和免疫印跡方法觀察,發(fā)現(xiàn)SVCV感染鯉上皮瘤細(xì)胞（EPC）后可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SVCV的糖蛋白（G）在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)熒光定量PCR,免疫印跡和病毒滴度測(cè)定分析抑制或激活細(xì)胞自噬后病毒滴度和mRNA的變化,我們發(fā)現(xiàn)自噬對(duì)SVCV的復(fù)制及病毒粒子的釋放具有促進(jìn)作用,且該作用是通過(guò)及時(shí)清除受損的線粒體延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步分析發(fā)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 鯉春病毒血癥病毒研究進(jìn)展
        1.1.1 SVC流行特點(diǎn)
        1.1.2 SVCV生物學(xué)特性
        1.1.3 SVCV基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.4 SVCV的結(jié)構(gòu)蛋白
            1.1.4.1 核蛋白
            1.1.4.2 基質(zhì)蛋白
            1.1.4.3 糖蛋白
            1.1.4.4 磷蛋白
            1.1.4.5 病毒依賴性RNA聚合酶蛋白
    1.2 細(xì)胞自噬研究概論
        1.2.1 細(xì)胞自噬的種類(lèi)及過(guò)程
        1.2.2 細(xì)胞自噬的分子機(jī)理
        1.2.3 細(xì)胞自噬的信號(hào)通路調(diào)節(jié)
        1.2.4 細(xì)胞自噬的常用研究方法
            1.2.4.1 掃描透射電鏡觀察
            1.2.4.2 免疫熒光技術(shù)
            1.2.4.3 Western blot檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3的表型變化
            1.2.4.4 長(zhǎng)壽蛋白的降解
            1.2.4.5 p62的降解
        1.2.5 細(xì)胞自噬與病毒感染的研究進(jìn)展
        1.2.6 細(xì)胞自噬與機(jī)體免疫研究進(jìn)展
    1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)方法及研究現(xiàn)狀
2 研究目的及意義
3 SVCV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生和分子機(jī)理
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 細(xì)胞、毒株
        3.2.2 載體與質(zhì)粒
        3.2.3 引物序列及siRNA
        3.2.4 主要試劑
        3.2.5 培養(yǎng)基與抗生素及其配制
        3.2.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
        3.2.7 分子生物學(xué)分析軟件
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 Western blot實(shí)驗(yàn)
            3.3.2.1 樣品制備
            3.3.2.2 SDS-PAGE電泳
            3.3.2.3 Western Blot檢測(cè)分析
        3.3.3 siRNA及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        3.3.4 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        3.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)
        3.3.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性
        3.3.7 透射電鏡觀察
        3.3.8 熒光定量PCR分析
        3.3.9 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒滴度測(cè)定
        3.3.10 紫外滅活病毒的制備
        3.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 SVCV感染EPC細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
            3.4.1.1 EGFP-LC3融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.4.1.2 掃描透射電鏡觀察SVCV感染細(xì)胞后形成自噬泡結(jié)構(gòu)
            3.4.1.3 SVCV感染EPC細(xì)胞有自噬小體的點(diǎn)狀聚集
            3.4.1.4 SVCV感染EPC細(xì)胞后LC3的表達(dá)變化
        3.4.2 細(xì)胞自噬促進(jìn)SVCV的增殖
            3.4.2.1. 自噬抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞毒性的影響
            3.4.2.2 細(xì)胞自噬對(duì)SVCV mRNA復(fù)制的影響
            3.4.2.3 細(xì)胞自噬對(duì)SVCV粒子釋放的影響
            3.4.2.4 干擾LC3和Beclin-1基因表達(dá)抑制SVCV復(fù)制和釋放
            3.4.2.5 細(xì)胞自噬對(duì)SVCV入侵的作用
        3.4.3 SVCV誘導(dǎo)EPC細(xì)胞自噬機(jī)理的探討
            3.4.3.1 SVCV入侵可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
            3.4.3.2 SVCV/G可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
            3.4.3.3 mTOR蛋白在SVCV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中的作用
            3.4.3.4 ERK蛋白在SVCV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中的作用
            3.4.3.5 SVCV通過(guò)激活ERK蛋白抑制mTOR蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
        3.4.4 細(xì)胞自噬促進(jìn)病毒復(fù)制機(jī)理的初步探討
            3.4.4.1 細(xì)胞自噬通過(guò)延長(zhǎng)被感染細(xì)胞的存活時(shí)間促進(jìn)病毒復(fù)制
            3.4.4.2 細(xì)胞自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體
    3.5 討論與結(jié)論
        3.5.1 討論
            3.5.1.1 SVCV感染宿主細(xì)胞產(chǎn)生完全細(xì)胞自噬
            3.5.1.2 細(xì)胞自噬促進(jìn)SVCV的增殖
            3.5.1.3 mTOR-RK途徑參與SVCV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)程
        3.5.2 結(jié)論
4 SVCV感染宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 細(xì)胞、毒株
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.4 生物信息學(xué)分析軟件
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 細(xì)胞總蛋白質(zhì)的制備
        4.3.2 雙向凝膠電泳
            4.3.2.1 第一向固相pH梯度等電聚焦
            4.3.2.2 第二向SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳
            4.3.2.3 凝膠染色
            4.3.2.4 雙向凝膠電泳圖像掃描及圖像分析
        4.3.3 制備質(zhì)譜樣品
        4.3.4 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋
        4.3.5 差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析
        4.3.6 Western blot分析
        4.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量分析
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 雙向電泳和質(zhì)譜鑒定的差異蛋白分析
        4.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證SVCV感染的差異性蛋白
        4.4.3 Western blot驗(yàn)證SVCV感染的差異性蛋白
    4.5 討論與結(jié)論
        4.5.1 SVCV感染導(dǎo)致細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的改變
        4.5.2 SVCV感染導(dǎo)致泛素蛋白酶體途徑（UPP）相關(guān)蛋白的改變
        4.5.3 SVCV感染導(dǎo)致信號(hào)通路相關(guān)蛋白的改變
        4.5.4 SVCV感染導(dǎo)致生物代謝相關(guān)蛋白的改變
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3154642