水霉病為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常見(jiàn)病,危害較大。對(duì)于水霉病的防治尚無(wú)有效的化學(xué)藥物,但利用生物之間的拮抗作用進(jìn)行疾病防治,在漁業(yè)生產(chǎn)中已有應(yīng)用。本研究擬分離獲得水霉病原菌,進(jìn)行種屬鑒定;探討其生長(zhǎng)條件;以強(qiáng)致病性菌株作為指示菌,篩選水霉病原菌拮抗菌,進(jìn)行種屬鑒定;優(yōu)化拮抗菌培養(yǎng)條件;探索拮抗機(jī)理,并對(duì)拮抗活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化,為魚類水霉病的生物防治奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:(1)從感染水霉病的羅非魚病灶處分離得到一株水霉,經(jīng)鑒定此水霉屬于水霉科,水霉屬,擬為水霉屬中一新種,命名為Saprolegnia LF04;攻毒實(shí)驗(yàn)證明LF04對(duì)鯉魚魚卵的感染率為90%,對(duì)河魲魚卵的感染率為52%;最適生長(zhǎng)溫度為25℃,pH為7.0,對(duì)無(wú)機(jī)鹽比較敏感,2%的鹽度能完全抑制其生長(zhǎng);(2)以水霉病原菌LF04作為病原指示菌分離篩選出2株具有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌:JL04和JL50;經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定,JL04為枯草芽孢桿菌,JL50為短小芽孢桿菌。(3)魚體攻毒和水霉防治實(shí)驗(yàn)證明,兩株拮抗菌對(duì)魚體沒(méi)有毒性,魚體感染水霉的概率降低了45%(JL04)和38.4%(JL50);傳代實(shí)驗(yàn)證明,兩株拮抗菌的拮抗特性都能穩(wěn)定的遺傳給后代;JL04的拮抗譜較JL50要廣,JL50只對(duì)特定水霉菌株(LF04、LF01)有拮抗性,JL04菌株更能適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)需要。(4)拮抗菌拮抗機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)JL04菌株發(fā)酵液對(duì)水霉菌絲的抑制率為70%,無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)水霉菌絲的抑制率為40%,均能抑制水霉孢子萌發(fā),因此分析認(rèn)為該拮抗菌是分泌拮抗物質(zhì)至培養(yǎng)液中發(fā)揮作用;無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)溫度、pH、蛋白酶K敏感,故分析認(rèn)為拮抗物質(zhì)性質(zhì)為蛋白質(zhì);發(fā)酵液蛋白粗品經(jīng)過(guò)分子篩層析和SDS-PAGE電泳檢測(cè),確定具有拮抗活性蛋白分子量大約為2.7*104Da。因此該拮抗菌的拮抗機(jī)制為分泌具有拮抗活性的蛋白質(zhì)至胞外抑制水霉菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)。(5)拮抗菌JL04發(fā)酵條件及培養(yǎng)基優(yōu)化:發(fā)酵條件的研究結(jié)果表明菌株JL04對(duì)溫度和pH較為敏感,其生長(zhǎng)最適溫度為32℃,最適pH在5.0-6.0之間,接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響不顯著;通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),初步得到了在實(shí)驗(yàn)室條件下的JL04菌株液體發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化配方:6 g/L胰蛋白胨,6 g/L葡萄糖,3.5 g/L酵母提取物,3.5 g/L硝酸銨,2 g/L硫酸鎂,3 g/L氯化鈣,1 g/L硫酸錳。優(yōu)化后的培養(yǎng)基,其生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的時(shí)間縮短了2h,無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)菌絲的抑制率提高了12.5%。
【學(xué)位單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S941.431
【部分圖文】：

3.3 水霉 LF04 的理化性質(zhì)3.3.1 溫度對(duì)水霉 LF04 生長(zhǎng)的影響圖2-1表示水霉LF04培養(yǎng)72小時(shí)以后的生長(zhǎng)情況�？芍�，水霉LF04最適生長(zhǎng)溫度為25℃，在溫度達(dá)到或超過(guò)35℃時(shí)，水霉LF04無(wú)法生長(zhǎng)，而其在15℃時(shí)雖然生長(zhǎng)速度緩慢，但還在生長(zhǎng)，說(shuō)明水霉LF04的生長(zhǎng)受溫度影響較大，不同溫度間有顯著性差異：水霉LF04的生長(zhǎng)環(huán)境更適宜低溫，當(dāng)溫度升高時(shí)，水霉LF04的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制

圖2-1溫度對(duì)水霉LF04生長(zhǎng)的影響Fig2-1 The temperature effect on growth of Saprolegnia LFO4注： a、b、c、d、e字母不同表示組間有顯著性差異（p<0.05）,下同 .3.3.2 pH 對(duì)水霉 LF04 生長(zhǎng)的影響圖2-2顯示了水霉LF04在不同pH條件下培養(yǎng)72小時(shí)后的生長(zhǎng)情況。可知，水霉LF04受pH的影響較大，不同pH間有顯著性差異。水霉LF04最適生長(zhǎng)pH是7，過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境都會(huì)抑制水霉菌絲的生長(zhǎng)；當(dāng)pH為4時(shí)，水霉LF04的生長(zhǎng)完全被抑制；當(dāng)pH為7時(shí)，水霉在生長(zhǎng)72小時(shí)后鋪滿平板。eee

de圖2-3顯示了水霉LF04在不同鹽度條件下培養(yǎng)72小時(shí)后的生長(zhǎng)情況�？芍筁F04對(duì)鹽度非常敏感，0.5%濃度的NaCl都會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)形成抑制。在鹽度達(dá)到2%以上時(shí)，水霉菌絲的生長(zhǎng)完全受到抑制。當(dāng)空白水霉長(zhǎng)滿平板時(shí)，1%的NaCl對(duì)水霉得抑制率達(dá)到了41%。圖2-3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)水霉LF04生長(zhǎng)的影響Fig2-3 The NaCl effect on growth of Saprolegnia LFO4圖2-3顯示了水霉LF04在不同鹽度條件下培養(yǎng)72小時(shí)后的生長(zhǎng)情況�？芍�，水霉LF04對(duì)鹽度非常敏感，0.5%濃度的NaCl都會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)形成抑制。在鹽度達(dá)到2%以上時(shí)，水霉菌絲的生長(zhǎng)完全受到抑制。當(dāng)空白水霉長(zhǎng)滿平板時(shí)，1%的NaCl對(duì)水霉得抑制率達(dá)到了41%。3.4 水霉 LF04 鑒定3.4.1 水霉 LF04 形態(tài)特征由圖2-4可知，水霉LF04菌絲為透明管狀。孢子囊呈紡錘狀
【參考文獻(xiàn)】

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