由于近些年,盲目的追求高產(chǎn)、超高密度的養(yǎng)殖、技術(shù)混亂、藥物濫用、病害流行、種苗質(zhì)量差、環(huán)境污染等原因,對對蝦的養(yǎng)殖帶來很大的影響。為了探究弧菌在對蝦養(yǎng)殖過程中的流行病學(xué)、耐藥性以及致病性,本研究針對本實驗室保存的上海、江蘇、浙江、福建、海南等地海水養(yǎng)殖中發(fā)病對蝦、魚、蟹等的病料分理出的弧菌對這些弧菌進(jìn)行耐藥性的檢測,利用PCR的方法檢測各個菌株攜帶整合子的情況,對這些菌株進(jìn)行耐藥基因的檢測,以及運用最小抑菌濃度法MIC來研究各個地區(qū)的弧菌耐藥情況,針對耐藥基因型和耐藥表型對該菌做出正確的判斷,對耐藥株地區(qū)的人工養(yǎng)殖進(jìn)行臨床指導(dǎo),合理利用抗生素來預(yù)防細(xì)菌性疾病,為臨床指導(dǎo)提供了理論依據(jù)。在沿海5個省份采集到的患病動物和養(yǎng)殖水體等,這些樣品主要采自凡納濱對蝦和青蟹的血淋巴、肝胰腺、肌肉組織等;和分離自鱸魚、舌鰨、大菱鲆、河豚等的體表潰瘍、腸道、腹水和血液樣品。1、耐藥性分析本文主要進(jìn)行了194株弧菌對8種抗生素的MIC值和耐藥基因的檢測,研究了分離菌株的耐藥情況,對耐藥表型和耐藥基因型的相關(guān)性進(jìn)行了比較,簡單的總結(jié)了弧菌在各地區(qū)的耐藥情況。194株菌的MIC值可以看出耐藥率最高的為紅霉素和復(fù)方新諾明,分別為60.8%和58.2%;而對于鏈霉素,則處于中介范圍的菌株較多,有156株;耐藥率最低的藥物為氟苯尼考,僅有7.7%。從不同動物分離到的弧菌對8種抗菌藥物的耐藥率有所不同,從魚類分離到的弧菌耐藥率相對較高,蟹類的最低且對氟苯尼考和土霉素耐藥率均為0。還對194株弧菌檢測了1、2、3類整合子和4類整合子所包含的整合酶基因。二類和三類整合酶均未檢測到,一類整合酶檢出率高達(dá)95.4%。194株菌中,其中11株菌均含有一類整合子的保守區(qū),檢出率為5.67%,但V-69、V-76、V-105這三株菌不但具有完整的整合子,而且還具有可變區(qū)基因盒。對可變區(qū)陽性PCR進(jìn)行T-A克隆測序后分別得到了1308bp、1308bp和1315bp,這三株弧菌含有相同的基因盒,為利福平ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(Rifampin ADP-ribosylating transferase,arr-3)和二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase,dfr A27)兩種耐藥基因盒,分別介導(dǎo)利福平和甲氧芐啶耐藥。2、對蝦源副溶血弧菌毒力基因檢測本章對試驗室保存的74株對蝦源副溶血弧菌進(jìn)行毒力基因的檢測和最近報道的副溶血弧菌pir A和pir B基因檢測,和弧菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SS1和T3SS2檢測;并對幾株副溶血弧菌進(jìn)行對蝦感染試驗,根據(jù)24h的半致死濃度LC50,判斷副溶血弧菌的致病性。檢測結(jié)果tdh和trh對基因均未檢測到,而tlh的檢出61株,檢出率為82.4%,T3SS1的檢出率較高,最高的毒力基因VP1670的檢出率最高為62.2%;而T3SS2的檢出率較低,最低的毒力基因VPA1362檢出率為0%。在副溶血弧菌中檢測pir A和pir B毒力因子,檢出率分別為23.0%和20.3%。3、V-76溶藻弧菌多重耐藥和致病性本研究從福建省福清采集的一尾凡納濱病蝦的腸道內(nèi)容物中分離得到一株溶藻弧菌,命名為:V-76。通過凡納濱對蝦回感實驗和微量肉湯稀釋法藥敏實驗來分別研究該菌株的致病性和耐藥性。此外,為了探究V-76的致病性和耐藥性的分子機制,本文還通過PCR方法對該菌進(jìn)行了毒力基因、整合子相關(guān)基因和耐藥基因的檢測。凡納濱對蝦回感實驗結(jié)果表明,四組分別注射了3.5×107cfu、3.5×106cfu、3.5×105cfu和3.5×104cfu V-76的對蝦均發(fā)生了死亡,各組的死亡率依次為100%、100%、80%和65%。除了trh、tox R和Ure R之外,其它的毒力基因均被檢出,包括tdh、tlh、tox S、Collagenase、Fla A、omp W、Asp A和fur。藥敏實驗結(jié)果顯示,V-76對多種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥,如氟苯尼考(32μg.m L-1)、多西環(huán)素(32μg.m L-1)、環(huán)丙沙星(64μg.m L-1)、氯霉素(128μg.m L-1)、鏈霉素(512μg.m L-1)、紅霉素(256μg.m L-1)、磺胺甲噁唑(2048μg.m L-1)、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(128/2432μg.m L-1)和利福平(64μg.m L-1)。值得注意的是,V-76對后七種藥物呈現(xiàn)出較高的耐藥水平,而且其新霉素的MIC值也到達(dá)3232μg.m L-1以上。經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn),此菌株攜帶有1類整合子與4類超級整合子SXT,且該1類整合子包含耐藥基因盒arr2-dfr A27。此外,在菌株V-76中還檢測到1型插入序列共同區(qū)ISCR1,其下游含有一個氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat2。另外,該菌還攜帶有其它耐藥基因,如str A、str B、flo R和qnr VC。DNA旋轉(zhuǎn)酶Gyr A和拓?fù)洚悩?gòu)酶par C中的位點突變常可造成氟喹諾酮類藥物耐藥,但在上述兩種酶中未發(fā)現(xiàn)氨基酸位點突變。綜上所述,溶藻弧菌V-76能夠?qū)е路布{濱對蝦的發(fā)病死亡,對多種抗菌藥物耐藥,且攜帶多種獨立基因和耐藥基因。以上結(jié)果表明養(yǎng)殖源弧菌的耐藥性已非常嚴(yán)重,提示我們應(yīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中規(guī)范抗菌藥物的使用,以達(dá)到控制耐藥菌的出現(xiàn)和擴散的目的。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S941.4
【部分圖文】：

中 V-69、V-76 和 V-105 等一類整合子可變區(qū)顯示陽性，在 185 株具有一類整酶的菌株中，可變區(qū)的陽性率為 1.6%，對陽性 PCR 進(jìn)行 T-A 克隆測序后分別到了 1308bp、1308bp 和 1315bp，與 NCBI 上面的序列進(jìn)行比對，詳細(xì)結(jié)果見圖 2-1 至 2-3.

圖2-2 V-76菌株基因盒擴增電泳圖及比對結(jié)果（節(jié)選）Fig.2-2 The results of V-76 gene cassette PCR amplified product and sequence alignment （ part

圖2-2 V-76菌株基因盒擴增電泳圖及比對結(jié)果（節(jié)選）Fig.2-2 The results of V-76 gene cassette PCR amplified product and sequence alignment
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本文編號：2875628