大菱鲆(Scophthalmus maximus)俗稱“多寶魚”,自從1992年由英國引入我國后,大菱鲆的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年擴大,目前已成為我國北方海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量最大的品種。但隨著高密度工廠化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展,細菌性病害問題日趨嚴重,嚴重制約了大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。目前大菱鲆細菌性病害的控制手段主要依賴于抗生素和消毒劑等化學藥物,但由此會帶來細菌耐藥性、養(yǎng)殖水體污染及海產(chǎn)品中藥物殘留問題。因此,隨著人們對海產(chǎn)品質(zhì)量安全要求的日益提高,迫切需要尋求一種高效安全、環(huán)境友好的抗菌制劑替代抗生素和消毒劑等化學藥物,并用于控制大菱鲆及其養(yǎng)殖環(huán)境中的致病菌,以實現(xiàn)從源頭上解決養(yǎng)殖大菱鲆中藥物殘留問題。植物精油(Essential oils)亦稱作植物揮發(fā)油,是從芳香植物中提取的具有揮發(fā)性的脂溶性天然化合物,具有多種生物學活性,如抗菌、驅(qū)殺寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)等。鑒于植物精油具有高效抗菌活性,近年來被視為潛在的抗生素替代品并用于防治水產(chǎn)動物細菌性疾病。本論文首先確定大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆的關鍵致病菌,在此基礎上,首次嘗試將植物精油作為抗生素替代品應用于養(yǎng)殖大菱鲆細菌性疾病的防治,具體研究內(nèi)容如下:(1)大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆細菌性病原的分離鑒定及抗生素藥敏實驗。論文完成了對大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆主要細菌性疾病的流行性病原調(diào)查和研究,實驗從大菱鲆養(yǎng)殖場采集患腹水、紅體、突眼和紅嘴4種典型臨床癥狀的病魚樣本,共分離純化出33株病原菌,通過透射電鏡觀察、16S rDNA測序、生理生化檢測最終鑒定歸為3種常見水產(chǎn)致病菌,分別為遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda,29株),大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi,1株)和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii,3株),通過人工攻毒回感試驗證實遲緩愛德華氏菌、大菱鲆弧菌和弗氏檸檬酸桿菌是引起大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆細菌性疾病的關鍵病原菌;采用Kriby-Bauer紙片擴散法完成了這3種致病菌(共選7株,E.tarda FS-S、HD-C及TY-X;V.scophthalmi HZ-C1;C.freundii HZ-W、HZ-C2及HZ-F)對30種抗生素的藥敏實驗,結(jié)果顯示受測菌株均具有多重耐藥現(xiàn)象,且存在株間差異性。(2)植物精油對養(yǎng)殖大菱鲆致病菌的體外抗菌活性及其機制。論文通過紙片擴散法和微量肉湯稀釋法研究了檸檬醛、山蒼子精油、肉桂醛、百里香酚等16種天然植物精油對遲緩愛德華氏菌、大菱鲆弧菌及弗氏檸檬酸桿菌3種致病菌(共選7株,E.tarda FS-S、HD-C及TY-X;V.scophthalmi HZ-C1;C.freundii HZ-W、HZ-C2及HZ-F)的抗菌活性,結(jié)果顯示肉桂醛、百里香酚和丁香酚對受測菌株具有較強抗菌活性,最小抑菌濃度均小于或等于1μL/mL;檸檬醛、檸檬草精油和山蒼子精油的抗菌活性次之,最小抑菌濃度范圍為0.25~4μL/mL,隨菌種和菌株不同而變化。此外,實驗又通過細菌形態(tài)掃描和透射電鏡觀察、胞內(nèi)乳酸脫氫酶及核酸釋放研究山蒼子精油對不同致病菌株的膜損傷作用,以初步闡明其抗菌機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)山蒼子精油可破壞致病菌株的細胞膜,并導致胞內(nèi)蛋白酶和核酸外泄,致使細菌死亡。(3)植物精油的體內(nèi)抗菌實驗。實驗選用山蒼子精油進行體內(nèi)攻毒治療實驗,分別對大菱鲆腹腔注射1×10~7CFU/尾E.tarta FS-S,2×10~7CFU/尾V.scophthalmi HZ-C1和1×10~7CFU/尾C.freundiiHZ-C2,攻毒后經(jīng)0.2μL/mL山蒼子精油藥浴后,大菱鲆死亡率分別由60%(6/10)降至20%(2/10),50%(5/10)降至0%(0/10),40%(4/10)降至20%(2/10),這為大菱鲆細菌性疾病的防治提供了另一種有效的抗生素替代品;以斑馬魚為模型,腹腔注射2×10~7CFU/尾E.tartaFS-S和1×10~6 CFU/尾C.freundiiHZ-C2,攻毒后經(jīng)0.2μL/mL山蒼子精油藥浴后,斑馬魚死亡率分別由90%(9/10)降至20%(2/10),60%(6/10)降至10%(1/10)�？傊�,本研究初步闡明了導致大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆病害的幾種主要病原,為養(yǎng)殖大菱鲆病害防治提供了病原學基礎。在此基礎上,我們首次探索利用天然植物精油作為抗生素替代品來防治幾種大菱鲆關鍵致病菌,并通過體外和體內(nèi)實驗證實了植物精油的抗菌效果,為實現(xiàn)海產(chǎn)品“免抗生素”生態(tài)健康養(yǎng)殖提供了新途徑。
【學位單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

患病及健康大菱鲆肝臟（A,C,E,G）及腸道（B,D,F,H）組織切片圖

部分分離菌株16SrDNA的PCR擴增結(jié)果

患病大Figure2-8Th菱鲆的典型臨heclinicalsig臨床癥狀（箭gnsofturbot(箭頭顯示吻部(arrowsindic部下頜明顯充catelocallesi充血）ons)
【參考文獻】

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本文編號：2875843