我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,但細(xì)菌疾病的爆發(fā),給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析法、熒光抗體法等免疫檢測方法均存在靈敏度低、背景熒光高等缺陷。時(shí)間分辨熒光免疫法可有效降低背景熒光,是一種靈敏、高效的檢測手段,已在致病菌、有毒化合物等免疫檢測上得到了廣泛地應(yīng)用。納米粒子可與多種生物大分子結(jié)合包括抗體,且不影響其生物活性,本研究建立了一種基于納米粒子的TRFIA檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌,研究內(nèi)容如下:(1)建立了直接納米粒子TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌B15,將細(xì)菌包被于微孔板,抗體標(biāo)記后的熒光納米粒子作為檢測抗體進(jìn)行檢驗(yàn)。采用正交試驗(yàn)對(duì)細(xì)菌包被時(shí)間、細(xì)菌包被溫度、納米粒子-抗體濃度進(jìn)行了優(yōu)化,得出嗜水氣單胞菌的最低檢測限為1.0×10~5cfu/mL。(2)為提高檢測靈敏度,將嗜水氣單胞菌B15的抗體直接包被于微孔板,建立了雙抗夾心納米粒子TRFIA法。正交試驗(yàn)法對(duì)包被抗體濃度、抗體包被時(shí)間、免疫反應(yīng)時(shí)間以及納米粒子-IgG濃度進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出最低檢測線為1.0×10~3cfu/mL。(3)引入生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)檢測嗜水氣單胞菌B15,進(jìn)一步提高靈敏度。將生物素標(biāo)記嗜水氣單胞菌B15的抗體,使用鏈霉親與熒光納米粒子偶聯(lián),建立了生物素親合素(Biotin-Avidin,BA)-納米粒子TRFIA法。采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化生物素化抗體濃度、生物素化抗體與BA-熒光納米粒子結(jié)合時(shí)間、BA-熒光納米粒子濃度,最終得出嗜水氣單胞菌B15的最低檢測線為8×10~2cfu/mL。
【學(xué)位單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S941.42
【部分圖文】：

圖 1-1 時(shí)間分辨熒光測定的原理.1.2 時(shí)間分辨免疫熒光檢測技術(shù)的新進(jìn)展.1.2.1 酶放大(Enzyme-amplified) TRFIA酶放大時(shí)間分辨免疫分析法，是把酶放大與 TRFIA 相結(jié)合的一種超靈敏生物分析法由 Diamandis 等在 Bobrow 等的工作基礎(chǔ)上提出的[17]。酶放大 TRFIA 的基本原理如圖 1-示，將捕捉蛋白包被于微孔板后依次加入分析物和生物素標(biāo)記的檢測抗體，形成了捕捉體-分析物-檢測抗體三元復(fù)合物，再向體系中加入鏈霉親和素標(biāo)記的酶如堿性磷酸酶ALP），通過堿性磷酸酶的作用將水楊酸磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的水楊酸衍生物。常用的 AL物為 5-氟水楊酸磷酸脂（5-FSAP），ALP 可將其分解為 5-氟水楊酸（5-FSA），5-氟水楊與鑭系元素（Tb3+）在堿性條件下和乙二胺四乙酸（EDTA）形成強(qiáng)熒光絡(luò)合物直接測定光，通過測量熒光強(qiáng)度可計(jì)算出待測物質(zhì)的含量[18]。由于酶放大 TRFIA 集中了酶放大用、生物素-鏈霉親和素的高親和力放大作用，鑭系元素 stokes 位移長，熒光壽命長等優(yōu)，是一種超靈敏、無放射性污染、無需外加增強(qiáng)液的分析方法。Jiang 等人[19]基于鑭系元

圖 1-2 酶放大鑭系熒光體系基本原理中 1 為捕捉抗體，2 為樣品分析物，3 為檢測抗體，4 為水解和氧化還原表 1-1 不同酶對(duì)應(yīng)的底物及檢測限對(duì)比 底物 檢測限酸酶 不同取代基的水楊酸磷酸鹽 0.2amol氧化酶 1,10-鄰二苯雜菲-2,9-二羧酸肼 2fmol氧化酶 水楊醛 10-6U苷酶 水楊-β-D-半乳糖苷 90amol熒光共振能量轉(zhuǎn)移的 TRFIA一種非輻射能量轉(zhuǎn)移過程，是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如nor, D）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體 Acceptor,A）的吸收光間的距離滿足一定條件時(shí)（一般小于 10nm），能量由處于激發(fā)作用以非輻射的方式傳遞到處于基態(tài)的受體[23, 24]。基于 FRE

圖 1-3 基于納米粒子的時(shí)間分辨熒光含 Eu 離子的納米粒子，2 為檢測抗體，3 為樣品相體系，形成了均相納米檢測體系。包含了記物相比有很高的比活度，如果將這種納米合物結(jié)合到納米粒子上，將輪流激發(fā)能量受的免疫分析，該實(shí)驗(yàn)將17β-雌二醇特異重組抗，作為能量供體，雌二醇與近紅外的染料 A方法特異性和靈敏度都很好，且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)Kokko 等人[98]還通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在聚苯乙烯螯合物相比，在對(duì)抗混合物干擾方面是否有性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，金屬離子的存在對(duì)熒光能量的耐受性更好，金屬離子和不同的pH對(duì)標(biāo)記溶性Eu螯合物和包含Eu螯合物的聚苯乙烯納米顆粒的方法其檢測限是普通可溶性Eu
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