我國水產養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,但細菌疾病的爆發(fā),給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失,而傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析法、熒光抗體法等免疫檢測方法均存在靈敏度低、背景熒光高等缺陷。時間分辨熒光免疫法可有效降低背景熒光,是一種靈敏、高效的檢測手段,已在致病菌、有毒化合物等免疫檢測上得到了廣泛地應用。納米粒子可與多種生物大分子結合包括抗體,且不影響其生物活性,本研究建立了一種基于納米粒子的TRFIA檢測水產養(yǎng)殖致病菌,研究內容如下:(1)建立了直接納米粒子TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌B15,將細菌包被于微孔板,抗體標記后的熒光納米粒子作為檢測抗體進行檢驗。采用正交試驗對細菌包被時間、細菌包被溫度、納米粒子-抗體濃度進行了優(yōu)化,得出嗜水氣單胞菌的最低檢測限為1.0×10~5cfu/mL。(2)為提高檢測靈敏度,將嗜水氣單胞菌B15的抗體直接包被于微孔板,建立了雙抗夾心納米粒子TRFIA法。正交試驗法對包被抗體濃度、抗體包被時間、免疫反應時間以及納米粒子-IgG濃度進行了優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化結果進行實驗,得出最低檢測線為1.0×10~3cfu/mL。(3)引入生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)檢測嗜水氣單胞菌B15,進一步提高靈敏度。將生物素標記嗜水氣單胞菌B15的抗體,使用鏈霉親與熒光納米粒子偶聯(lián),建立了生物素親合素(Biotin-Avidin,BA)-納米粒子TRFIA法。采用正交試驗法優(yōu)化生物素化抗體濃度、生物素化抗體與BA-熒光納米粒子結合時間、BA-熒光納米粒子濃度,最終得出嗜水氣單胞菌B15的最低檢測線為8×10~2cfu/mL。
【學位單位】：集美大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S941.42
【部分圖文】：

圖 1-1 時間分辨熒光測定的原理.1.2 時間分辨免疫熒光檢測技術的新進展.1.2.1 酶放大(Enzyme-amplified) TRFIA酶放大時間分辨免疫分析法，是把酶放大與 TRFIA 相結合的一種超靈敏生物分析法由 Diamandis 等在 Bobrow 等的工作基礎上提出的[17]。酶放大 TRFIA 的基本原理如圖 1-示，將捕捉蛋白包被于微孔板后依次加入分析物和生物素標記的檢測抗體，形成了捕捉體-分析物-檢測抗體三元復合物，再向體系中加入鏈霉親和素標記的酶如堿性磷酸酶ALP），通過堿性磷酸酶的作用將水楊酸磷酸鹽轉變?yōu)橄鄳乃畻钏嵫苌�。常用�?AL物為 5-氟水楊酸磷酸脂（5-FSAP），ALP 可將其分解為 5-氟水楊酸（5-FSA），5-氟水楊與鑭系元素（Tb3+）在堿性條件下和乙二胺四乙酸（EDTA）形成強熒光絡合物直接測定光，通過測量熒光強度可計算出待測物質的含量[18]。由于酶放大 TRFIA 集中了酶放大用、生物素-鏈霉親和素的高親和力放大作用，鑭系元素 stokes 位移長，熒光壽命長等優(yōu)，是一種超靈敏、無放射性污染、無需外加增強液的分析方法。Jiang 等人[19]基于鑭系元

圖 1-2 酶放大鑭系熒光體系基本原理中 1 為捕捉抗體，2 為樣品分析物，3 為檢測抗體，4 為水解和氧化還原表 1-1 不同酶對應的底物及檢測限對比 底物 檢測限酸酶 不同取代基的水楊酸磷酸鹽 0.2amol氧化酶 1,10-鄰二苯雜菲-2,9-二羧酸肼 2fmol氧化酶 水楊醛 10-6U苷酶 水楊-β-D-半乳糖苷 90amol熒光共振能量轉移的 TRFIA一種非輻射能量轉移過程，是指在兩個不同的熒光基團中，如nor, D）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體 Acceptor,A）的吸收光間的距離滿足一定條件時（一般小于 10nm），能量由處于激發(fā)作用以非輻射的方式傳遞到處于基態(tài)的受體[23, 24]�；� FRE

圖 1-3 基于納米粒子的時間分辨熒光含 Eu 離子的納米粒子，2 為檢測抗體，3 為樣品相體系，形成了均相納米檢測體系。包含了記物相比有很高的比活度，如果將這種納米合物結合到納米粒子上，將輪流激發(fā)能量受的免疫分析，該實驗將17β-雌二醇特異重組抗，作為能量供體，雌二醇與近紅外的染料 A方法特異性和靈敏度都很好，且易實現(xiàn)自動Kokko 等人[98]還通過實驗驗證了在聚苯乙烯螯合物相比，在對抗混合物干擾方面是否有性反應實驗中，金屬離子的存在對熒光能量的耐受性更好，金屬離子和不同的pH對標記溶性Eu螯合物和包含Eu螯合物的聚苯乙烯納米顆粒的方法其檢測限是普通可溶性Eu
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本文編號：2868954