中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又稱河蟹、毛蟹,是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物,市場需求量極大,但是隨著其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,集約化程度不斷提高,病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體大量繁殖,各種病害頻發(fā),嚴(yán)重影響河蟹養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,使養(yǎng)殖戶遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中華絨螯蟹“顫抖病”是河蟹養(yǎng)殖中最常見且最嚴(yán)重的疾病,引起該病的是一種新型水產(chǎn)病原微生物中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris)。本課題組前期研究證實,螺原體主要通過河蟹的鰓或體表進(jìn)入體內(nèi),并首先侵染其靶細(xì)胞—血淋巴細(xì)胞,在其細(xì)胞內(nèi)大量繁殖后隨著血淋巴液循環(huán)而侵染包括肝臟、心臟、消化道、鰓、肌肉、神經(jīng)等器官的結(jié)締組織中,引起河蟹感染前期的無力、不食,后期由于神經(jīng)組織中的病原大量侵染而引起河蟹附肢的顫抖,最終導(dǎo)致死亡。因此,探究螺原體侵染時,河蟹血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的機(jī)制,對降低該病菌對河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害有著深遠(yuǎn)的意義。本課題組前期利用iTraq技術(shù)篩選了螺原體侵染前后河蟹血淋巴細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白,并挑選了兩種重要的蛋白Rab7(EsRab7)和14-3-3Ζ(Es14-3-3Ζ)做了初步研究,證實它們參與到了螺原體侵染的過程中,本文在此基礎(chǔ)上對這兩個蛋白的功能做了進(jìn)一步的研究,包括篩選靶向互作microRNA,在細(xì)胞水平上開展RNA干擾和重組蛋白過表達(dá)實驗驗證其免疫功能,具體研究內(nèi)容從以下三個方面來開展:1.中華絨螯蟹EsRab7和Es14-3-3Ζ相互作用microRNA的鑒定及功能研究螺原體刺激后,河蟹血淋巴細(xì)胞中EsRab7的轉(zhuǎn)錄水平在6 h開始顯著上調(diào)并持續(xù)至24 h,Es14-3-3Ζ的蛋白表達(dá)量在12 h和24 h均顯著上調(diào),證實這兩種蛋白參與到了螺原體侵染的過程中。進(jìn)而雙熒光素酶報告基因檢測篩選得到兩種能夠分別靶向作用于EsRab7和Es14-3-3Ζ基因的microRNA:miR-131-3p和miR-2309,證實了它們能夠分別沉默EsRab7和Es14-3-3Ζ基因,并檢測了它們在河蟹各組織中的分布情況,結(jié)果顯示,兩者在肝胰腺中的表達(dá)均最高,其次為神經(jīng),并且在血淋巴中也有表達(dá)。在個體上用螺原體刺激河蟹后,檢測了10 d內(nèi)各時間點miR-131-3p和miR-2309在血淋巴和神經(jīng)中的表達(dá)譜,結(jié)果顯示在2-6 d,兩者在血淋巴中均呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢,而在神經(jīng)中,兩者均在4 d開始顯著下調(diào)并一直持續(xù)到10 d。以上結(jié)果說明河蟹被螺原體侵染后,miR-131-3p與EsRab7基因、miR-2309與Es14-3-3Ζ基因之間的調(diào)控關(guān)系在其免疫過程中發(fā)揮著重要的作用。2.中華絨螯蟹Rab7蛋白在螺原體入侵過程中的免疫功能研究利用化學(xué)合成的miR-131-3p成功干擾了河蟹血淋巴細(xì)胞中EsRab7基因,并在螺原體刺激24 h后,檢測了細(xì)胞形態(tài)和活力、抗菌肽表達(dá)、螺原體拷貝數(shù)等指標(biāo),結(jié)果顯示,EsRab7沉默組的細(xì)胞死亡最多,細(xì)胞活力和抗菌肽EsALF1、EsALF2和EsALF3的表達(dá)顯著低于對照組和inhibitor組,螺原體拷貝數(shù)顯著高于對照組和inhibitor組。在果蠅S2細(xì)胞中過表達(dá)了EsRab7-GFP蛋白并在螺原體刺激48 h后,檢測了細(xì)胞形態(tài)和活力、螺原體拷貝數(shù)等指標(biāo),結(jié)果顯示,過表達(dá)組的細(xì)胞存活最多,細(xì)胞活力顯著高于對照組,螺原體拷貝數(shù)顯著低于對照組。以上結(jié)果說明miR-131-3p與EsRab7基因相互作用在螺原體的侵染過程中發(fā)揮著重要的作用。3.中華絨螯蟹14-3-3Ζ蛋白在螺原體入侵過程中的免疫功能研究利用化學(xué)合成的miR-2309成功干擾了河蟹血淋巴細(xì)胞中Es14-3-3Ζ基因,并在螺原體刺激24 h后,檢測了細(xì)胞形態(tài)和活力、免疫相關(guān)基因表達(dá)、螺原體拷貝數(shù)等指標(biāo),結(jié)果顯示,Es14-3-3Ζ沉默組的細(xì)胞大批死亡,細(xì)胞活力、抗菌肽以及免疫相關(guān)基因Relish和ERK表達(dá)顯著低于對照組和inhibitor組,EsRab7轉(zhuǎn)錄水平也隨著Es14-3-3Ζ的變化而正相關(guān)改變,同時實驗組螺原體拷貝數(shù)顯著高于對照組和inhibitor組。利用過表達(dá)技術(shù)在果蠅S2細(xì)胞中過表達(dá)了Es14-3-3Ζ-GFP蛋白并加入螺原體刺激48 h后,檢測了細(xì)胞形態(tài)和活力、螺原體拷貝數(shù)等指標(biāo),結(jié)果顯示,過表達(dá)組的細(xì)胞存活最多,細(xì)胞活力顯著高于對照組,螺原體拷貝數(shù)顯著低于對照組。以上結(jié)果說明miR-2309與Es14-3-3Ζ基因相互作用在螺原體的侵染過程中執(zhí)行著重要的功能。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S945
【部分圖文】：

R CGTGCGGCCGCTGGTCAACCCACCTAACCCAF CGACTCGAGACGAGACAACCTGACGCTTTR CGTGCGGCCGCAGGCGGCCTGGAGTAGTAGics sense UUCCUUUCCCUUCCCUUCCUUs sense UGUGAGGGUGGUGGACGGCAGGGics sense GCAUACUGUCACGCUCCGAACA TTCCTTCCCTTCCCTTTCCTTTGTGAGGGTGGTGGACGGCAGGGCTTGCTTCGGCAGAACATATACTAACTGGTGTCGTGGAG巴中 EsRab7 mRNA 和 Es14-3-3Ζ 蛋白在 S. eriocheiris 刺EsRab7 和 Es14-3-3Ζ 在河蟹血淋巴免疫當(dāng)中的作用，應(yīng)用 術(shù)檢測在 S. eriocheiris 刺激血淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞中 EsRab的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，EsRab7 基因從 6 h 開始持續(xù)上調(diào) GAPDH 作為內(nèi)參（圖 2.1）。Es14-3-3Ζ 蛋白在 12 h 開始 β-actin 作為內(nèi)參蛋白（圖 2.2）。

estern blot 檢測在 S. eriocheiris 刺激后河蟹血細(xì)胞內(nèi) Es14-3-3Ζ 蛋變化。β-actin 作為內(nèi)參蛋白。.2 Western blot was carried out to detect the expression levels of the Es in hemocytes of E. sinensis after S. eriocheiris infected. β-actin as the protein.信息學(xué)預(yù)測 microRNA 與靶基因 3′UTR 的潛在作用位點篩選能夠與 EsRab7 和 Es14-3-3Ζ 相互作用的 microRNA，an(www. targetscan.org/ mamm 31/)，Miranda (www. microrna. org/ mrm. do)和 PITA (www. pita. ps/)軟件在線預(yù)測了 EsRab7 3′UTR 與 m，Es14-3-3Ζ 3′UTR 與 miR-2309（圖 2.4）的作用位點。

圖 2.2 Western blot 檢測在 S. eriocheiris 刺激后河蟹血細(xì)胞內(nèi) Es14-3-3Ζ 蛋白表達(dá)變化。β-actin 作為內(nèi)參蛋白。Fig. 2.2 Western blot was carried out to detect the expression levels of the Es14-3-3Ζprotein in hemocytes of E. sinensis after S. eriocheiris infected. β-actin as the referencprotein..3.3 生物信息學(xué)預(yù)測 microRNA 與靶基因 3′UTR 的潛在作用位點為了篩選能夠與 EsRab7 和 Es14-3-3Ζ 相互作用的 microRNA，我們采argetScan(www. targetscan.org/ mamm 31/)，Miranda (www. microrna. org/ microrna/irna Form. do)和 PITA (www. pita. ps/)軟件在線預(yù)測了 EsRab7 3′UTR 與 miR-131圖 2.3），Es14-3-3Ζ 3′UTR 與 miR-2309（圖 2.4）的作用位點。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 于漢壽;劉淑園;阮康勤;陳永萱;王志偉;;螺原體的分類及其生物多樣性研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)報;2009年05期

2 秦春娥;尿原體的研究進(jìn)展[J];江西畜牧獸醫(yī)雜志;2004年06期

3 張月季,洪健,吳金平,王阿根;植物螺原體的存活、分布及繁殖形式[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報;2000年01期

4 吳云鵬;用914治療豬枝原體肺炎[J];中國獸醫(yī)科技;1993年11期

5 葉旭東,郭永紅,黃為一,陳永萱;應(yīng)用熱變性法測定植物螺原體DNA的G+C含量[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1988年03期

6 陳永萱,薛寶娣,郭永紅;蜜蜂螺原體基本性狀的研究[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生物學(xué) 農(nóng)學(xué) 醫(yī)學(xué) 地學(xué));1988年02期

7 郭永紅,葉旭東,陳永萱,陳澤安;一種新的植物花螺原體(Spiroplasma)的研究[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1989年08期

8 王?,石培章,陳紀(jì)函;蜜蜂新病—螺原體病的防治初探[J];畜牧與獸醫(yī);1989年06期

9 李蘭桂;郭翠云;方國源;;禽敗毒枝原體S_6標(biāo)準(zhǔn)菌株在廣東Ⅰ號培養(yǎng)基生長良好[J];畜牧獸醫(yī)科技;1989年02期

10 王咢;;蜜蜂螺原體病的防治初探[J];蜜蜂雜志;1989年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 顧偉;中華絨螯蟹螺原體侵染小鼠3T6細(xì)胞的機(jī)制研究[D];南京師范大學(xué);2018年

2 朱歡喜;中華絨螯蟹螺原體磷脂代謝和精氨酸代謝中幾種關(guān)鍵蛋白的功能研究[D];南京師范大學(xué);2015年

3 修云吉;中華絨螯蟹螺原體侵染羅氏沼蝦血細(xì)胞過程中互作蛋白的篩選及功能研究[D];南京師范大學(xué);2015年

4 梁廷明;中華絨螯蟹螺原體重要功能基因的篩選和研究及螺原體與WSSV的多重PCR檢測技術(shù)[D];南京師范大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 原美君;螺原體感染果蠅S2細(xì)胞模型的建立及應(yīng)用[D];南京師范大學(xué);2019年

2 許學(xué)川;中華絨螯蟹Rab7和14-3-3Z蛋白在螺原體入侵過程中的免疫功能研究[D];南京師范大學(xué);2019年

3 安亮;蝦蟹螺原體免疫膠體金試紙條檢測技術(shù)的研究[D];南京師范大學(xué);2015年

4 周丹霞;蜜蜂螺原體Spiroplasma melliferum CH-1細(xì)胞骨架相關(guān)基因的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 劉曉丹;目無膽甾原體分離鑒定及其外膜蛋白研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

6 李新倫;羅氏沼蝦螺原體病原微生物的分離和生物學(xué)特性研究[D];南京師范大學(xué);2012年

7 劉淑園;我國部分昆蟲螺原體的基本特性及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 連林坤;蝦蟹螺原體病免疫組化和病理學(xué)比較研究[D];南京師范大學(xué);2011年

9 俞徐斌;牛虻和家蠅螺原體的生物學(xué)特性及蜜蜂螺原體致病相關(guān)因子的探索[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 回麗靜;膜翅目昆蟲螺原體的研究及我國部分螺原體遺傳多樣性分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

本文編號：2867964