中華鱉(Trionyx sinensis),分類學(xué)上隸屬爬行綱(Reptilia)、龜鱉(Testudinata)。在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江流域和華南地區(qū),而西藏、青海和新疆較少;國(guó)外主要分布于朝鮮、日本和越南。由于中華鱉具有很大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值,使得近些年來(lái)中華鱉的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展非常迅速,其養(yǎng)殖方式多樣,主要包括魚鱉混養(yǎng)、池塘單養(yǎng)和工廠化溫室養(yǎng)殖等,2015年年產(chǎn)量突破了34萬(wàn)噸。但是在市場(chǎng)利益驅(qū)動(dòng)下,許多養(yǎng)殖場(chǎng)育種操作不規(guī)范,特別是近親繁殖,導(dǎo)致中華鱉種苗質(zhì)量良莠不齊,種質(zhì)出現(xiàn)退化,生長(zhǎng)速度減慢,這些狀況阻礙了中華鱉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,因此我們開(kāi)展了中華鱉良種選育工作,希望能夠利用分子標(biāo)記選育出快長(zhǎng)的中華鱉良種品系,以滿足人類的消費(fèi)需求,促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,也希望為中華鱉的種質(zhì)保護(hù)和良種選育提供一些基礎(chǔ)資料和參考數(shù)據(jù),從而促進(jìn)龜鱉類種質(zhì)鑒定與保護(hù)、良種選育的繁榮發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)主要是根據(jù)的中華鱉基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),設(shè)計(jì)SSR引物,大規(guī)模開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記,并對(duì)中華鱉的三個(gè)群體共72個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性分析。然后利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)綠卡(LK)鱉群體的120個(gè)體進(jìn)行生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析,篩選出其生長(zhǎng)相關(guān)的SSR分子標(biāo)記。此外,本實(shí)驗(yàn)還將功能基因用于育種研究,以胰島素樣生長(zhǎng)因子I(Insulin-like growth factor 1,IGF1)作為候選基因,進(jìn)行基因克隆和序列多態(tài)性分析,并利用SNP進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,擬從中找到中華鱉生長(zhǎng)相關(guān)SNPs分子標(biāo)記,將其應(yīng)用于鱉的生產(chǎn)養(yǎng)殖上,選育出生長(zhǎng)速度快、飼料利用率高的優(yōu)質(zhì)中華鱉養(yǎng)殖新品種,并進(jìn)行示范推廣。1.中華鱉微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及三個(gè)群體遺傳多樣性研究利用中華鱉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選獲得20對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物。基于此,對(duì)中華鱉的三個(gè)群體(黃沙群體、洞庭群體和日本群體)共72個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析。20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在三個(gè)群體中顯示出很高的多態(tài)性,等位基因數(shù)為3-26,觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.208-0.958和0.302-0.963,多態(tài)信息含量為0.283-0.953�；谏鲜龇治鼋Y(jié)果,利用MEGA5.0對(duì)中華鱉種群構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹,可知,三個(gè)群體中,黃沙群體和洞庭群體先聚合然后再和日本群體聚合,說(shuō)明黃沙群體與洞庭群體的親緣關(guān)系較近,而它們與日本群體親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),這與它們的地理分布是一致的。本研究開(kāi)發(fā)的20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記可作為中華鱉遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)、分子標(biāo)記輔助育種等研究的理想分子標(biāo)記。2.中華鱉生長(zhǎng)相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記篩選及應(yīng)用分析利用篩選到的25個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,以中華鱉(綠卡群體)極大、極小兩個(gè)群體共120個(gè)個(gè)體為實(shí)驗(yàn)材料,分析這些微衛(wèi)星標(biāo)記與體重、背甲長(zhǎng)、背甲寬、體高、腹甲長(zhǎng)及腹甲寬之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:有3個(gè)位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性達(dá)到顯著(P0.05)或極顯著水平(P0.01),其中位點(diǎn)LTF1與體重、背甲長(zhǎng)、背甲寬、腹甲長(zhǎng)、腹甲寬、體高均極顯著相關(guān);位點(diǎn)LTR87與體重、背甲長(zhǎng)、和腹甲寬顯著相關(guān);位點(diǎn)LT8與體重、體高、腹甲長(zhǎng)、腹甲寬顯著相關(guān)。將同一性狀不同基因型之間進(jìn)行多重比較,結(jié)果顯示位點(diǎn)LTF1中的BE型,位點(diǎn)LTR87中的BB型,以及位點(diǎn)LT8中的CF型、BC型、AC型、CC型具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),可作為輔助育種的參考標(biāo)記。3.中華鱉IGF1基因克隆、序列多態(tài)性分析及生長(zhǎng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選通過(guò)克隆獲得了中華鱉的IGF1基因的c DNA序列,序列長(zhǎng)為710bp,其中開(kāi)放閱讀框(ORF)為460bp,編碼153個(gè)氨基酸。并將中華鱉的IGF1的c DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種的c DNA序列進(jìn)行blastn對(duì)比分析,結(jié)果顯示,IGF1序列在進(jìn)化上較為保守,中華鱉與其他物種的相似性較高,為85%-98%。利用MEGA5.0對(duì)中華鱉IGF1的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果顯示,中華鱉IGF1基因的氨基酸序列與綠海龜(Chelonia mydas)中相應(yīng)氨基酸序列的親緣關(guān)系最近,與同屬于龜鱉目的西部錦龜(Chrysemys Picta bellii)匯為一支,而與原雞(Gallus gallus)、揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis)、小鼠(Mus musculus)及人類(Homo sapiens)中相應(yīng)的氨基酸序列的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從中華鱉的極大和極小兩個(gè)群體的IGF1基因中共篩選到5個(gè)有效的SNP位點(diǎn)S1、S2、S3、S4和S5,均位于IGF1的ORF區(qū)。SNP位點(diǎn)的基因型與中華鱉兩個(gè)群體生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示:S1位點(diǎn)的GG基因型和S3位點(diǎn)的TT基因型對(duì)應(yīng)個(gè)體的各個(gè)生長(zhǎng)性狀都顯著高于同一位點(diǎn)其他基因型個(gè)體。5個(gè)SNP位點(diǎn)共組成9種雙倍型(D1-D9),其中D9與D5雙倍型與中華鱉生長(zhǎng)性狀發(fā)揮正面效應(yīng),而D1雙倍型與中華鱉的生長(zhǎng)性狀有負(fù)面影響;D9與D5為極大群體中的優(yōu)勢(shì)雙倍型,D1為極小群體的優(yōu)勢(shì)雙倍型。以上結(jié)果表明中華鱉IGF1基因中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)S1處GG基因型、S3處TT基因型及雙倍型D9和D5與中華鱉的快長(zhǎng)密切相關(guān),可以作為中華鱉分子標(biāo)記輔助育種的候選標(biāo)記。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

利用中華鱉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了 100 對(duì)微衛(wèi)星引物，通過(guò)篩選，獲得 20對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物。20 對(duì)微衛(wèi)星引物在 3 個(gè)群體 72 個(gè)個(gè)體中都能擴(kuò)增出多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強(qiáng)的清晰條帶。遺傳參數(shù)見(jiàn)表 2。黃沙群體、洞庭群體和日本群體的等位基因數(shù)分別為 3-22,3-26 和 3-20，黃沙種群的觀測(cè)雜合度為0.208-0.952，期望雜合度為 0.302- 0.957；洞庭種群的觀測(cè)雜合度為 0.208-0.958，期望雜合度為 0.395-0.975；日本種群的觀測(cè)雜合度為 0.208-0.952，期望雜合度為 0.355-0.973；根據(jù) 0.25<PIC<0.50 屬于中度多態(tài)性，PIC>0.5 屬于高度多態(tài)性可知，在 3 個(gè)種群中的多態(tài)信息含量分別為 0.283-0.953, 0.283-0.934 和0.363-0.950。其中黃沙群體和洞庭群體中多態(tài)信息含量有 3 個(gè)處于中度多態(tài)水平，其他的都處于高度多態(tài)水平；日本群體中有 4 個(gè)處于中度多態(tài)水平，其他的都處于高度多態(tài)水平。哈迪溫伯格平衡定律的偏離在表 2 中用“*”表示。基于微衛(wèi)星分析結(jié)果，利用 MEGA5.0 對(duì)中華鱉種群構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，見(jiàn)圖2-1。從圖中可知，黃沙群體和洞庭群體先聚合然后再和日本群體聚合，說(shuō)明黃沙群體與洞庭群體的親緣關(guān)系較近，而他們與日本群體親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這與它們的地理分布是一致的，而且這一研究結(jié)果與劉陽(yáng)等人的研究結(jié)果一致[87]。

圖 4-2 中華鱉 IGF1 和其它脊椎動(dòng)物的分子進(jìn)化樹Fig 4-2: The IGF1 phylogenetic tree of Trionyx sinensis and other reptilia.2 IGF1 結(jié)構(gòu)分析以 NCBI 登錄的鱉的 cDNA 為模板，所設(shè)計(jì)的上下游引物擴(kuò)增出一0bp 的條帶，利用 Protparam 軟件在線分析中華鱉 IGF1 氨基酸序列，結(jié)果顯華鱉 IGF1 的分子式為 C755H1205N223O217S15分子量為 17.3591KDa，共包含 原子。中華鱉 IGF1 多肽鏈的氨基酸組成和比例見(jiàn)圖 4-3，其中氨基酸（）天冬氨酸和谷氨酸（Asp+Glu）的總數(shù)為 12，氨基酸（正電荷）精氨酸酸（Arg+Lys）總數(shù)為 22，理論等電位點(diǎn)（PI）為 9.27.預(yù)測(cè)該蛋白不穩(wěn)定，I不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為 41.20。IGF1 的脂溶系數(shù)（Aliphatic ind 72.03，總平均親水性系數(shù)（Grand average of hydropathicity GRAVY）為-0.

圖 4-3 中華鱉 IGF1 基因的氨基酸組成ig4-3 The amino acids composition of Trionyx sinensis IGF 軟件對(duì)中華鱉的 IGF1 的親\疏水性進(jìn)行分析，結(jié)系數(shù)最低，為-2.289，表明該氨基酸位點(diǎn)親水性最最高，為 2.511，表明該氨基酸位點(diǎn)疏水性最強(qiáng)
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