中華鱉(Trionyx sinensis),分類學上隸屬爬行綱(Reptilia)、龜鱉(Testudinata)。在我國主要分布于長江流域和華南地區(qū),而西藏、青海和新疆較少;國外主要分布于朝鮮、日本和越南。由于中華鱉具有很大的營養(yǎng)價值、觀賞價值和藥用價值,使得近些年來中華鱉的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展非常迅速,其養(yǎng)殖方式多樣,主要包括魚鱉混養(yǎng)、池塘單養(yǎng)和工廠化溫室養(yǎng)殖等,2015年年產(chǎn)量突破了34萬噸。但是在市場利益驅(qū)動下,許多養(yǎng)殖場育種操作不規(guī)范,特別是近親繁殖,導致中華鱉種苗質(zhì)量良莠不齊,種質(zhì)出現(xiàn)退化,生長速度減慢,這些狀況阻礙了中華鱉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,因此我們開展了中華鱉良種選育工作,希望能夠利用分子標記選育出快長的中華鱉良種品系,以滿足人類的消費需求,促進產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,也希望為中華鱉的種質(zhì)保護和良種選育提供一些基礎(chǔ)資料和參考數(shù)據(jù),從而促進龜鱉類種質(zhì)鑒定與保護、良種選育的繁榮發(fā)展。本實驗主要是根據(jù)的中華鱉基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),設(shè)計SSR引物,大規(guī)模開發(fā)分子標記,并對中華鱉的三個群體共72個個體進行了遺傳多樣性分析。然后利用SSR分子標記技術(shù)和分子生物學技術(shù)對綠卡(LK)鱉群體的120個體進行生長性狀的相關(guān)分析,篩選出其生長相關(guān)的SSR分子標記。此外,本實驗還將功能基因用于育種研究,以胰島素樣生長因子I(Insulin-like growth factor 1,IGF1)作為候選基因,進行基因克隆和序列多態(tài)性分析,并利用SNP進行關(guān)聯(lián)性分析,擬從中找到中華鱉生長相關(guān)SNPs分子標記,將其應(yīng)用于鱉的生產(chǎn)養(yǎng)殖上,選育出生長速度快、飼料利用率高的優(yōu)質(zhì)中華鱉養(yǎng)殖新品種,并進行示范推廣。1.中華鱉微衛(wèi)星標記的開發(fā)及三個群體遺傳多樣性研究利用中華鱉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選獲得20對具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物�；诖�,對中華鱉的三個群體(黃沙群體、洞庭群體和日本群體)共72個個體進行遺傳多樣性分析。20個微衛(wèi)星位點在三個群體中顯示出很高的多態(tài)性,等位基因數(shù)為3-26,觀測雜合度和期望雜合度分別為0.208-0.958和0.302-0.963,多態(tài)信息含量為0.283-0.953。基于上述分析結(jié)果,利用MEGA5.0對中華鱉種群構(gòu)建遺傳進化樹,可知,三個群體中,黃沙群體和洞庭群體先聚合然后再和日本群體聚合,說明黃沙群體與洞庭群體的親緣關(guān)系較近,而它們與日本群體親緣關(guān)系相對較遠,這與它們的地理分布是一致的。本研究開發(fā)的20個微衛(wèi)星標記可作為中華鱉遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)、分子標記輔助育種等研究的理想分子標記。2.中華鱉生長相關(guān)微衛(wèi)星標記篩選及應(yīng)用分析利用篩選到的25個微衛(wèi)星標記,以中華鱉(綠卡群體)極大、極小兩個群體共120個個體為實驗材料,分析這些微衛(wèi)星標記與體重、背甲長、背甲寬、體高、腹甲長及腹甲寬之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:有3個位點與生長性狀的相關(guān)性達到顯著(P0.05)或極顯著水平(P0.01),其中位點LTF1與體重、背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬、體高均極顯著相關(guān);位點LTR87與體重、背甲長、和腹甲寬顯著相關(guān);位點LT8與體重、體高、腹甲長、腹甲寬顯著相關(guān)。將同一性狀不同基因型之間進行多重比較,結(jié)果顯示位點LTF1中的BE型,位點LTR87中的BB型,以及位點LT8中的CF型、BC型、AC型、CC型具有明顯的生長優(yōu)勢,可作為輔助育種的參考標記。3.中華鱉IGF1基因克隆、序列多態(tài)性分析及生長相關(guān)SNP位點的篩選通過克隆獲得了中華鱉的IGF1基因的c DNA序列,序列長為710bp,其中開放閱讀框(ORF)為460bp,編碼153個氨基酸。并將中華鱉的IGF1的c DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種的c DNA序列進行blastn對比分析,結(jié)果顯示,IGF1序列在進化上較為保守,中華鱉與其他物種的相似性較高,為85%-98%。利用MEGA5.0對中華鱉IGF1的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析,結(jié)果顯示,中華鱉IGF1基因的氨基酸序列與綠海龜(Chelonia mydas)中相應(yīng)氨基酸序列的親緣關(guān)系最近,與同屬于龜鱉目的西部錦龜(Chrysemys Picta bellii)匯為一支,而與原雞(Gallus gallus)、揚子鱷(Alligator sinensis)、小鼠(Mus musculus)及人類(Homo sapiens)中相應(yīng)的氨基酸序列的親緣關(guān)系較遠。從中華鱉的極大和極小兩個群體的IGF1基因中共篩選到5個有效的SNP位點S1、S2、S3、S4和S5,均位于IGF1的ORF區(qū)。SNP位點的基因型與中華鱉兩個群體生長性狀之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示:S1位點的GG基因型和S3位點的TT基因型對應(yīng)個體的各個生長性狀都顯著高于同一位點其他基因型個體。5個SNP位點共組成9種雙倍型(D1-D9),其中D9與D5雙倍型與中華鱉生長性狀發(fā)揮正面效應(yīng),而D1雙倍型與中華鱉的生長性狀有負面影響;D9與D5為極大群體中的優(yōu)勢雙倍型,D1為極小群體的優(yōu)勢雙倍型。以上結(jié)果表明中華鱉IGF1基因中單核苷酸多態(tài)性位點S1處GG基因型、S3處TT基因型及雙倍型D9和D5與中華鱉的快長密切相關(guān),可以作為中華鱉分子標記輔助育種的候選標記。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

利用中華鱉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計開發(fā)了 100 對微衛(wèi)星引物，通過篩選，獲得 20對具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物。20 對微衛(wèi)星引物在 3 個群體 72 個個體中都能擴增出多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強的清晰條帶。遺傳參數(shù)見表 2。黃沙群體、洞庭群體和日本群體的等位基因數(shù)分別為 3-22,3-26 和 3-20，黃沙種群的觀測雜合度為0.208-0.952，期望雜合度為 0.302- 0.957；洞庭種群的觀測雜合度為 0.208-0.958，期望雜合度為 0.395-0.975；日本種群的觀測雜合度為 0.208-0.952，期望雜合度為 0.355-0.973；根據(jù) 0.25<PIC<0.50 屬于中度多態(tài)性，PIC>0.5 屬于高度多態(tài)性可知，在 3 個種群中的多態(tài)信息含量分別為 0.283-0.953, 0.283-0.934 和0.363-0.950。其中黃沙群體和洞庭群體中多態(tài)信息含量有 3 個處于中度多態(tài)水平，其他的都處于高度多態(tài)水平；日本群體中有 4 個處于中度多態(tài)水平，其他的都處于高度多態(tài)水平。哈迪溫伯格平衡定律的偏離在表 2 中用“*”表示�；谖⑿l(wèi)星分析結(jié)果，利用 MEGA5.0 對中華鱉種群構(gòu)建遺傳進化樹，見圖2-1。從圖中可知，黃沙群體和洞庭群體先聚合然后再和日本群體聚合，說明黃沙群體與洞庭群體的親緣關(guān)系較近，而他們與日本群體親緣關(guān)系相對較遠，這與它們的地理分布是一致的，而且這一研究結(jié)果與劉陽等人的研究結(jié)果一致[87]。

圖 4-2 中華鱉 IGF1 和其它脊椎動物的分子進化樹Fig 4-2: The IGF1 phylogenetic tree of Trionyx sinensis and other reptilia.2 IGF1 結(jié)構(gòu)分析以 NCBI 登錄的鱉的 cDNA 為模板，所設(shè)計的上下游引物擴增出一0bp 的條帶，利用 Protparam 軟件在線分析中華鱉 IGF1 氨基酸序列，結(jié)果顯華鱉 IGF1 的分子式為 C755H1205N223O217S15分子量為 17.3591KDa，共包含 原子。中華鱉 IGF1 多肽鏈的氨基酸組成和比例見圖 4-3，其中氨基酸（）天冬氨酸和谷氨酸（Asp+Glu）的總數(shù)為 12，氨基酸（正電荷）精氨酸酸（Arg+Lys）總數(shù)為 22，理論等電位點（PI）為 9.27.預測該蛋白不穩(wěn)定，I不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為 41.20。IGF1 的脂溶系數(shù)（Aliphatic ind 72.03，總平均親水性系數(shù)（Grand average of hydropathicity GRAVY）為-0.

圖 4-3 中華鱉 IGF1 基因的氨基酸組成ig4-3 The amino acids composition of Trionyx sinensis IGF 軟件對中華鱉的 IGF1 的親\疏水性進行分析，結(jié)系數(shù)最低，為-2.289，表明該氨基酸位點親水性最最高，為 2.511，表明該氨基酸位點疏水性最強
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本文編號：2867913