非特異性免疫是機(jī)體抵抗外源病原菌入侵的第一道防線,同時(shí)在清除病原菌、修復(fù)損傷組織、激活和調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。非特異性免疫系統(tǒng)由細(xì)胞免疫和體液免疫組成,體液免疫系統(tǒng)中最重要的組成成分是能識(shí)別病原體相關(guān)分子模式的體液模式識(shí)別分子。在哺乳動(dòng)物中,血清淀粉樣P成分(serum amyloid P component,SAP)和正五聚蛋白-1(pentraxin-1,PTX1)作為經(jīng)典的體液模式識(shí)別分子,擁有進(jìn)化上保守的功能,如激活和調(diào)控補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮凝集、中和和調(diào)理作用,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等。然而,目前有關(guān)魚類SAP和PTX1的功能研究十分有限,特別是免疫功能研究。在本論文中,我們克隆了半滑舌鰨SAP(CsSAP)和PTX1(CsPTX1)基因,分析了它們?cè)趍RNA水平上的表達(dá)變化情況,并檢測(cè)了CsSAP和CsPTX1重組蛋白(rCsSAP和rCsPTX1)的抗細(xì)菌和抗病毒免疫作用。CsSAP的開放性閱讀框有672個(gè)堿基,共編碼224個(gè)氨基酸。CsSAP與已知魚類的SAP樣蛋白有46%-58%的序列相似性,且在細(xì)菌和病毒感染的情況下表達(dá)量顯著上調(diào)。功能研究結(jié)果表明,rCsSAP能結(jié)合多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌,且這種結(jié)合活性有蛋白濃度依賴性和菌種特異性。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rCsSAP結(jié)合細(xì)菌后,能顯著增強(qiáng)宿主吞噬細(xì)胞的吞噬活性。體內(nèi)組織侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),rCsSAP能有效幫助宿主抵抗細(xì)菌和病毒感染。與此相反,特異性抗體封閉宿主體內(nèi)天然的CsSAP后,半滑舌鰨清除入侵細(xì)菌的能力顯著降低。這些結(jié)果首次證明了魚類的SAP蛋白在宿主抗細(xì)菌和抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。CsPTX1蛋白包含223個(gè)氨基酸,與其它已知魚類的正五聚蛋白有38.8%-49.3%的序列相似性。正常生理?xiàng)l件下,CsPTX1在多個(gè)組織中均有表達(dá),且在細(xì)菌和病毒感染的情況下表達(dá)量顯著上調(diào)。由于CsPTX1包含一個(gè)能結(jié)合胞外抗原的正五聚蛋白結(jié)構(gòu)域,因此rCsPTX1能與多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌相互作用。同時(shí),rCsPTX1也能以鈣依賴的方式使細(xì)菌發(fā)生凝集。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),rCsPTX1對(duì)細(xì)菌包膜的滲透性有一定的影響,進(jìn)而抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)和增殖。體內(nèi)組織侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),rCsPTX1能有效幫助宿主抵抗細(xì)菌感染。上述結(jié)果表明,CsPTX1作為經(jīng)典的模式識(shí)別分子,能促進(jìn)半滑舌鰨抗細(xì)菌感染,在宿主非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：Q78;S917.4
【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第一章 緒論
    第一節(jié) 魚類的非特異性免疫系統(tǒng)
        1.1 細(xì)胞免疫
            1.1.1 吞噬細(xì)胞
            1.1.2 非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞
            1.1.3 上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞
        1.2 體液免疫
            1.2.1 細(xì)胞相關(guān)受體
            1.2.2 體液可溶性分子
        1.3 魚類的免疫組織和器官
            1.3.1 胸腺
            1.3.2 頭腎
            1.3.3 脾臟
            1.3.4 黏膜相關(guān)淋巴組織
    第二節(jié) 正五聚體蛋白在非特異性免疫系統(tǒng)中的作用
    第三節(jié) SAP和PTX1的研究現(xiàn)狀
        3.1 SAP和PTX1的發(fā)現(xiàn)及分子特征
        3.2 SAP的功能研究
        3.3 PTX1的功能研究
    第四節(jié) 本研究的目的和意義
第二章 半滑舌鰨重組CsSAP的抗菌、抗病毒作用研究
    第一節(jié) 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半滑舌鰨
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株（如下表）
            1.1.3 實(shí)驗(yàn)病毒株
            1.1.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器設(shè)備
            1.1.5 實(shí)驗(yàn)中涉及的分析軟件
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 正常生理?xiàng)l件下各組織中CsSAP的表達(dá)
            1.2.2 細(xì)菌、病毒感染后CsSAP的表達(dá)變化
            1.2.3 構(gòu)建表達(dá)CsSAP重組蛋白（rCsSAP）的原核表達(dá)載體
            1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)、純化rCsSAP
            1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)rCsSAP與細(xì)菌間的相互作用
            1.2.6 免疫熒光顯微鏡術(shù)驗(yàn)證rCsSAP對(duì)熒光假單胞菌的結(jié)合作用
            1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rCsSAP對(duì)外周血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響
            1.2.8 組織侵染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rCsSAP對(duì)半滑舌鰨抗細(xì)菌、抗病毒免疫的影響
            1.2.9 抗體封閉CsSAP對(duì)半滑舌鰨抗細(xì)菌免疫的影響
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.1 CsSAP序列分析
        2.2 CsSAP基因的組成型表達(dá)譜
        2.3 細(xì)菌、病毒感染后CsSAP基因在免疫組織中的表達(dá)
        2.4 rCsSAP重組蛋白結(jié)合革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌
        2.5 rCsSAP-細(xì)菌復(fù)合物影響宿主外周血淋巴細(xì)胞的吞噬活性
        2.6 rCsSAP對(duì)舌鰨抗細(xì)菌和抗病毒的作用
        2.7 抗體封閉CsSAP對(duì)舌鰨抗細(xì)菌免疫反應(yīng)的作用
    第三節(jié) 討論
    第四節(jié) 小結(jié)
第三章 半滑舌鰨CsPTX1的免疫功能研究
    第一節(jié) 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)步驟
            1.2.1 生物信息學(xué)軟件分析CsPTX1基因序列
            1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增CsPTX1基因
            1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)CsPTX1基因的組成型表達(dá)
            1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)菌、病毒刺激后CsPTX1基因的表達(dá)變化
            1.2.5 構(gòu)建表達(dá)CsPTX1重組蛋白（rCsPTX1）的原核表達(dá)載體
            1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá)、純化重組CsPTX1蛋白（rCsPTX1）
            1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)rCsPTX1對(duì)細(xì)菌的結(jié)合活性
            1.2.8 rCsPTX1凝集細(xì)菌實(shí)驗(yàn)
            1.2.9 體外抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rCsPTX1對(duì)細(xì)菌的影響
            1.2.10 掃描電鏡檢測(cè)細(xì)菌形態(tài)變化
            1.2.11 組織侵染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rCsPTX1對(duì)舌鰨抗細(xì)菌感染的影響
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.1 CsPTX1序列分析
        2.2 正常生理?xiàng)l件下CsPTX1基因的組成型表達(dá)譜
        2.3 細(xì)菌、病毒刺激后CsPTX1基因在免疫組織中的表達(dá)
        2.4 rCsPTX1結(jié)合革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌
        2.5 rCsPTX1凝集革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌
        2.6 rCsPTX1對(duì)細(xì)菌體外增殖和生存的影響
        2.7 rCsPTX1對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響
        2.8 rCsPTX1對(duì)舌鰨抗細(xì)菌免疫反應(yīng)的影響
    第三節(jié) 討論
    第四節(jié) 小結(jié)
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