C型凝集素是指具有一個(gè)或多個(gè)鈣依賴型碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)的動物凝集素,存在于幾乎所有后生動物中,在先天免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮重要作用。在脊椎動物中,C型凝集素是保守的,大多數(shù)僅含有一個(gè)碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域,而無脊椎動物的C型凝集素類型更加多樣化,功能也更復(fù)雜,對無脊椎動物C型凝集素的研究有助于先天免疫機(jī)制的闡明,能夠豐富C型凝集素家族的研究。擬穴青蟹是我國重要的養(yǎng)殖蟹類,主要分布在長江以南的東南沿海地區(qū),但人工養(yǎng)殖中蟹苗存活率低,細(xì)菌或病毒感染會加重這一情況。擬穴青蟹屬于無脊椎動物,僅具有先天性免疫系統(tǒng),研究青蟹的先天免疫機(jī)制以提高其自身免疫力對于生產(chǎn)具有十分重要的意義。本研究獲得了三條擬穴青蟹C型凝集素基因,并對青蟹進(jìn)行病原脅迫實(shí)驗(yàn),利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對其進(jìn)行表達(dá)模式分析,獲得了以下成果:1.通過RACE法成功克隆得到了擬穴青蟹一種含CTLD結(jié)構(gòu)域的C型凝集素基因,將其命名為SpCTLD。該基因cDNA序列全長為1237bp,包含一個(gè)468bp的開放閱讀框,編碼155個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量為18.32KDa,等電點(diǎn)為7.56。該基因在第390位(A390G)和第1020位(T1020C)含有兩個(gè)SNP位點(diǎn)。對SpCTLD在擬穴青蟹幼體不同時(shí)期和組織中的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),SpCTLD在幼體的各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá),其中在溞狀幼體Ⅴ期表達(dá)量最高,仔蟹Ⅰ期次之,仔蟹Ⅱ期最低。對SpCTLD的組織分布分析表明,鰓中表達(dá)量最高,其次為射精管,二者表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組織,在血淋巴、肝胰腺等其他免疫相關(guān)組織中也有表達(dá)。副溶血弧菌脅迫實(shí)驗(yàn)表明,活菌組的肝胰腺、血淋巴、鰓中mRNA表達(dá)量發(fā)生明顯上調(diào),且都在第12小時(shí)達(dá)到最高。根據(jù)本研究結(jié)果推測SpCTLD是一種含CTLD結(jié)構(gòu)域的新基因,它可能參與了擬穴青蟹抗細(xì)菌反應(yīng)。該基因的發(fā)現(xiàn)豐富了擬穴青蟹C型凝集素相關(guān)基因的研究,有利于完善甲殼動物先天免疫機(jī)制的研究。2.本研究獲得了擬穴青蟹另外兩條C型凝集素基因:SpMR和SpCollectin-12-like。SpMR基因的cDNA序列全長為1762bp,包含一個(gè)936bp的開放閱讀框,編碼311個(gè)氨基酸,還包括一個(gè)258bp的5′UTR和一個(gè)568bp的3′UTR。預(yù)測其分子量為35.4KDa,等電點(diǎn)為4.12,含有一個(gè)長18個(gè)氨基酸的信號肽。編碼區(qū)存在兩個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD),分別為第30到第157個(gè)氨基酸和第180到307個(gè)氨基酸,在此區(qū)域內(nèi)各含有一個(gè)保守識別基序EPN和WND。SpCollectin-12-like的cDNA全長為2293bp,包含一個(gè)819bp的開放閱讀框,編碼272個(gè)氨基酸,含有一個(gè)346bp的5′UTR和一個(gè)1128bp的3′UTR。預(yù)測其分子量為29.8KDa,等電點(diǎn)為6.09,含有一個(gè)長24個(gè)氨基酸的信號肽。編碼區(qū)存在一個(gè)CTLD結(jié)構(gòu)域,為第143-266個(gè)氨基酸,在此區(qū)域內(nèi)含有一個(gè)保守識別基序WND。通過副溶血弧菌脅迫實(shí)驗(yàn),初步證明二者參與了擬穴青蟹的抗細(xì)菌免疫反應(yīng)。本研究豐富了C型凝集素在擬穴青蟹先天免疫中的研究,有助于推動相關(guān)免疫增強(qiáng)劑的開發(fā),對于完善甲殼動物先天免疫機(jī)制的研究有積極意義,有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

CTLD的結(jié)構(gòu)

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文兩個(gè) SNP 位點(diǎn)（A390G,T1020C），開放閱讀框?yàn)?468bp，編碼 155 個(gè)氨基酸外還有 82bp 的 5′ UTR 和 687bp 的 3′ UTR，在 3′ UTR 區(qū)域含有典型的加尾AATAAA（圖 2.1）。預(yù)測其蛋白分子量為 18.32kDa，等電點(diǎn)為 7.56。TargetServer 和 Mitoprot 預(yù)測該蛋白定位于線粒體，含有信號肽，為分泌蛋白，該預(yù)靠性等級為 1（最高等級可信度）。線粒體靶向序列為第 1 到 14 個(gè)氨（MAPSRPLVLLTVLL），切割位點(diǎn)為第 15 個(gè)氨基酸（S）。信號肽預(yù)測為到 21 個(gè)氨基酸，信號肽 N 端為第 1 到 6 個(gè)氨基酸，疏水核心區(qū)為第 7 到 16基酸，C 端為第 17 到 21 個(gè)氨基酸。配體結(jié)合位點(diǎn)為 124E, 128A, 130N, 136K, 139S, 140E, 141Y, 144D, 145Y, 146K。結(jié)構(gòu)域 CTLD 位于第 26 到第 151 個(gè)氨基在第 89-91 個(gè)氨基酸出現(xiàn)了 Ca2+特征性識別基序 LND。

2.2.2 SpCTLD 在擬穴青蟹幼體和組織中的表達(dá)從溞狀幼體 I 期到仔蟹Ⅱ期，SpCTLD 在擬穴青蟹幼體各個(gè)時(shí)期均有表2.2），并且整體表達(dá)量較高。從 Z1 期到 Z4 期整體表達(dá)量較為穩(wěn)定，至 Z到最高點(diǎn)，而后至 M 期和 C1 期略有下降，C2 期表達(dá)量大幅下降，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低時(shí)期，達(dá)到最低點(diǎn)。qPCR 檢測 SpCTLD 在擬穴青蟹不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，SpCTLD 測的 12 個(gè)組織（血淋巴 HE、肝胰腺 HEP、眼柄 ET、射精管 ETU、精巢 T肉 MU、鰓 GI、心臟 H、大觸角 ATA、小觸角 ATU、Y 器 YO、表皮 CU）表達(dá)（圖 2.3），其中在鰓中表達(dá)量最高，射精管次之，且兩者的 mRNA 表遠(yuǎn)高于其他組織。肝胰腺、表皮、大觸角、小觸角、血淋巴、肌肉這幾個(gè)表達(dá)量比較接近，但遠(yuǎn)低于鰓和射精管。心臟、Y 器、眼柄以及精巢的 mR達(dá)量較為接近，呈現(xiàn)顯著低表達(dá)（P<0.05）。
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本文編號：2862589