發(fā)布時間：2020-10-30 13:40

　　 東北林蛙(Rana dybowskii)在我國主要分布于東北地區(qū),該地區(qū)處于亞寒帶,長達6個月的冬眠期對東北林蛙的生存造成極大的威脅。本實驗室前期研究表明東北林蛙在低溫狀態(tài)下機體積累大量葡萄糖作為抗凍保護物質抵御低溫傷害。糖原合成酶(glycogen synthase,GS)是糖原合成限速酶,直接參與糖原合成與分解過程。絲/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinases,Akt)作為胰島素信號通路上的重要激酶,不僅參與糖代謝調節(jié),而且在機體受到低溫因素刺激時抑制細胞凋亡。本實驗主要研究東北林蛙在低溫狀態(tài)下GS和Akt2 mRNA表達量變化,為探明機體如何產(chǎn)生高糖且耐高糖機制奠定基礎。本實驗以東北地區(qū)兩棲類優(yōu)勢代表物種東北林蛙為研究對象,設4℃為對照組,-1℃為實驗組,進行低溫脅迫,分別在脅迫4h、8h、12h、24h、48h、72h時間點對其心臟、肝臟和骨骼肌取樣,提取總RNA。采用PCR技術及RACE法克隆東北林蛙GS和Akt2基因序列,并對其進行蛋白結構分析;采用q PCR技術檢測GS和Akt2 mRNA表達,探究其在低溫過程中的動態(tài)變化。實驗結果:RACE法獲得東北林蛙GS基因全長2855bp,開放閱讀框2214bp,編碼737個氨基酸;東北林蛙Akt2基因全長1976bp,開放閱讀框1461bp,編碼486個氨基酸。qPCR檢測顯示低溫脅迫下東北林蛙GS mRNA在心臟、肝臟、骨骼肌中表達水平均呈顯著下調(p0.05),其中,心臟在8h降至最低,為對照組的9%,24h時基本恢復;在肝臟和骨骼肌則持續(xù)呈低水平表達,均在4h降至最低,分別為對照組的17%和4%。低溫脅迫下東北林蛙Akt2 mRNA表達水平在心臟、肝臟中均呈顯著上調(p0.05),12h達高峰,其中,心臟和肝臟分別為對照組的4.4倍和4.6倍,72h時基本恢復正常;而骨骼肌則變化不顯著。本研究首次獲得東北林蛙GS和Akt2的基因全長序列,并對低溫脅迫下東北林蛙GS和Akt2分子的時空表達變化進行了分析,結果顯示GS mRNA表達顯著下調,Akt2mRNA表達顯著上調,為進一步探索東北林蛙低溫糖代謝相關研究提供理論依據(jù)。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 緒論
    1.1 變溫動物耐低溫機制
        1.1.1 耐寒性
        1.1.2 耐凍性
        1.1.3 低溫代謝調節(jié)
        1.1.4 抗凍保護劑
        1.1.5 代謝相關酶的調節(jié)
    1.2 胰島素信號通路及其相關的重要因子
        1.2.1 胰島素與胰島素信號通路
        1.2.2 PI3K與PDK1
        1.2.3 Akt/PKB
        1.2.4 GSK3β 與GS
    1.3 東北林蛙
    1.4 蛙類低溫生理學研究
    1.5 本實驗研究目的及意義
2 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要實驗儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 GS、Akt2 mRNA序列及引物設計
        2.2.2 低溫脅迫
        2.2.3 組織總RNA提取
        2.2.4 cDNA合成
        2.2.5 RACE法獲得東北林蛙GS、Akt2基因全長cDNA序列
        2.2.6 東北林蛙GS、Akt2基因全長cDNA序列的生物信息學分析
        2.2.7 mRNA表達水平的檢測
    2.3 本章小結
3 結果與分析
    3.1 東北林蛙總RNA提取
    3.2 東北林蛙GS、Akt2 cDNA基因序列全長及蛋白分析
        3.2.1 東北林蛙GS、Akt2基因全長克隆及結構分析
        3.2.2 東北林蛙GS、Akt2氨基酸與其他物種序列同源性比較
        3.2.3 東北林蛙GS、Akt2蛋白一級結構預測
        3.2.4 東北林蛙GS、Akt2磷酸位點分析
        3.2.5 東北林蛙GS、Akt2編碼氨基酸的信號肽預測
        3.2.6 不同物種間GS、Akt2蛋白多重序列比對
    3.3 東北林蛙GS、Akt2的基因表達分析
        3.3.1 引物特異性驗證
        3.3.2 東北林蛙GS、Akt2的擴增溶解曲線
        3.3.3 東北林蛙GS、Akt2 mRNA表達分析
    3.4 本章小結
4 討論
    4.1 抗凍物質葡萄糖
    4.2 東北林蛙GS結構與功能
    4.3 東北林蛙GS低溫脅迫表達變化
    4.4 東北林蛙Akt2結構與功能
    4.5 東北林蛙Akt2低溫脅迫表達變化
結論
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝

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本文編號：2862548