東北林蛙(Rana dybowskii)在我國(guó)主要分布于東北地區(qū),該地區(qū)處于亞寒帶,長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的冬眠期對(duì)東北林蛙的生存造成極大的威脅。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明東北林蛙在低溫狀態(tài)下機(jī)體積累大量葡萄糖作為抗凍保護(hù)物質(zhì)抵御低溫傷害。糖原合成酶(glycogen synthase,GS)是糖原合成限速酶,直接參與糖原合成與分解過(guò)程。絲/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinases,Akt)作為胰島素信號(hào)通路上的重要激酶,不僅參與糖代謝調(diào)節(jié),而且在機(jī)體受到低溫因素刺激時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)主要研究東北林蛙在低溫狀態(tài)下GS和Akt2 mRNA表達(dá)量變化,為探明機(jī)體如何產(chǎn)生高糖且耐高糖機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以東北地區(qū)兩棲類(lèi)優(yōu)勢(shì)代表物種東北林蛙為研究對(duì)象,設(shè)4℃為對(duì)照組,-1℃為實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)行低溫脅迫,分別在脅迫4h、8h、12h、24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)對(duì)其心臟、肝臟和骨骼肌取樣,提取總RNA。采用PCR技術(shù)及RACE法克隆東北林蛙GS和Akt2基因序列,并對(duì)其進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析;采用q PCR技術(shù)檢測(cè)GS和Akt2 mRNA表達(dá),探究其在低溫過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:RACE法獲得東北林蛙GS基因全長(zhǎng)2855bp,開(kāi)放閱讀框2214bp,編碼737個(gè)氨基酸;東北林蛙Akt2基因全長(zhǎng)1976bp,開(kāi)放閱讀框1461bp,編碼486個(gè)氨基酸。qPCR檢測(cè)顯示低溫脅迫下東北林蛙GS mRNA在心臟、肝臟、骨骼肌中表達(dá)水平均呈顯著下調(diào)(p0.05),其中,心臟在8h降至最低,為對(duì)照組的9%,24h時(shí)基本恢復(fù);在肝臟和骨骼肌則持續(xù)呈低水平表達(dá),均在4h降至最低,分別為對(duì)照組的17%和4%。低溫脅迫下東北林蛙Akt2 mRNA表達(dá)水平在心臟、肝臟中均呈顯著上調(diào)(p0.05),12h達(dá)高峰,其中,心臟和肝臟分別為對(duì)照組的4.4倍和4.6倍,72h時(shí)基本恢復(fù)正常;而骨骼肌則變化不顯著。本研究首次獲得東北林蛙GS和Akt2的基因全長(zhǎng)序列,并對(duì)低溫脅迫下東北林蛙GS和Akt2分子的時(shí)空表達(dá)變化進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示GS mRNA表達(dá)顯著下調(diào),Akt2mRNA表達(dá)顯著上調(diào),為進(jìn)一步探索東北林蛙低溫糖代謝相關(guān)研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 緒論
    1.1 變溫動(dòng)物耐低溫機(jī)制
        1.1.1 耐寒性
        1.1.2 耐凍性
        1.1.3 低溫代謝調(diào)節(jié)
        1.1.4 抗凍保護(hù)劑
        1.1.5 代謝相關(guān)酶的調(diào)節(jié)
    1.2 胰島素信號(hào)通路及其相關(guān)的重要因子
        1.2.1 胰島素與胰島素信號(hào)通路
        1.2.2 PI3K與PDK1
        1.2.3 Akt/PKB
        1.2.4 GSK3β 與GS
    1.3 東北林蛙
    1.4 蛙類(lèi)低溫生理學(xué)研究
    1.5 本實(shí)驗(yàn)研究目的及意義
2 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 GS、Akt2 mRNA序列及引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 低溫脅迫
        2.2.3 組織總RNA提取
        2.2.4 cDNA合成
        2.2.5 RACE法獲得東北林蛙GS、Akt2基因全長(zhǎng)cDNA序列
        2.2.6 東北林蛙GS、Akt2基因全長(zhǎng)cDNA序列的生物信息學(xué)分析
        2.2.7 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)
    2.3 本章小結(jié)
3 結(jié)果與分析
    3.1 東北林蛙總RNA提取
    3.2 東北林蛙GS、Akt2 cDNA基因序列全長(zhǎng)及蛋白分析
        3.2.1 東北林蛙GS、Akt2基因全長(zhǎng)克隆及結(jié)構(gòu)分析
        3.2.2 東北林蛙GS、Akt2氨基酸與其他物種序列同源性比較
        3.2.3 東北林蛙GS、Akt2蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.2.4 東北林蛙GS、Akt2磷酸位點(diǎn)分析
        3.2.5 東北林蛙GS、Akt2編碼氨基酸的信號(hào)肽預(yù)測(cè)
        3.2.6 不同物種間GS、Akt2蛋白多重序列比對(duì)
    3.3 東北林蛙GS、Akt2的基因表達(dá)分析
        3.3.1 引物特異性驗(yàn)證
        3.3.2 東北林蛙GS、Akt2的擴(kuò)增溶解曲線
        3.3.3 東北林蛙GS、Akt2 mRNA表達(dá)分析
    3.4 本章小結(jié)
4 討論
    4.1 抗凍物質(zhì)葡萄糖
    4.2 東北林蛙GS結(jié)構(gòu)與功能
    4.3 東北林蛙GS低溫脅迫表達(dá)變化
    4.4 東北林蛙Akt2結(jié)構(gòu)與功能
    4.5 東北林蛙Akt2低溫脅迫表達(dá)變化
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝

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