大鯢(Andrias davidanus)是我國特有的有尾兩棲類,國家Ⅱ級重點保護野生動物。近年來隨著大鯢人工繁育技術(shù)的突破,大鯢養(yǎng)殖作為一種新興特種水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在我國蓬勃發(fā)展。已有的研究表明,在幼鯢性腺分化期,用較高水溫飼養(yǎng)使大多數(shù)幼鯢分化為雄鯢,而在同樣的水溫條件下,使用適宜濃度的外源17β-雌二醇(17β-E2)處理幼鯢使其又全部誘變成雌鯢。從2012年到2013年,于每年12月初將2000尾幼鯢隨機平均分為實驗組和對照組,實驗組幼鯢使用適宜濃度的外源17β-E2處理40 d。取8、12、20和36月齡大鯢性腺,采用解剖學(xué)與一般組織學(xué)技術(shù)對其進行了性別鑒定。選取了與有尾兩棲類性別決定和性腺分化相關(guān)的Sox9、Cyp19和Esr1基因,采用RT-PCR技術(shù)測定了這些基因的表達變化情況。旨在探尋這些基因在大鯢性別決定和性腺分化中的作用,初步探討大鯢的性腺分化及性別決定的分子機制,為大鯢產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展以及大鯢這個古老物種的種族延續(xù)提供理論依據(jù)。主要結(jié)果與結(jié)論如下:1.外源17β-E2可以誘導(dǎo)大鯢性腺全部分化為卵巢,且與對照組卵巢相比未見組織學(xué)異常。2.首次擴增出了大鯢Cyp19、Esr1基因的部分cDNA序列。3.在8、12、20和36月齡對照組大鯢性腺中,卵巢Sox9基因的表達呈上升趨勢,36月齡Sox9基因的表達較其他3個時期極顯著升高(P0.01);精巢Sox9基因的表達呈先上升再下降趨勢;卵巢Sox9基因表達水平極顯著高于相應(yīng)時期的精巢(P0.01)。表明Sox9基因可能參與了大鯢卵黃的合成過程。4.在8、12、20和36月齡對照組大鯢性腺中,卵巢Cyp19基因的表達水平呈逐漸降低趨勢,8月齡Cyp19基因的表達極顯著高于其他3個時期(P0.01);精巢Cyp19基因的表達基本呈現(xiàn)上升趨勢;卵巢Cyp19基因表達水平極顯著高于相應(yīng)時期的精巢(P0.01)。說明Cyp19基因可能在大鯢的性腺分化和卵巢發(fā)育中具有重要作用。5.在8、12、20和36月齡對照組大鯢性腺中,8月齡卵巢Esr1基因的表達極顯著高于其他3個時期(P0.01),12、20、36月齡Esr1基因表達呈逐漸上升趨勢;精巢Esr1基因始終保持較高的表達水平;除8月齡外,12、20和36月齡精巢Esr1基因表達極顯著高于相應(yīng)時期的卵巢(P0.01)。表明Esr1基因可能參與了卵巢的分化和發(fā)育,還可能與卵母細胞發(fā)育以及精原細胞形成有關(guān)。6.8、12、20月齡實驗組與對照組大鯢Sox9、Cyp19、Esr1基因的表達沒有顯著差異,表明早期用外源17β-E2處理幼鯢后,實驗組大鯢沒有外源17β-E2的明顯殘留。
【學(xué)位單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

??積累與ＰＣＲ產(chǎn)物積累同步［９５ｊ?（圖１－２）。ＴａｑＭａｎ探針自身具有特異性序列，因而所??檢測目的基因特異性強，且其產(chǎn)生的熒光強度與ＰＣＲ產(chǎn)物的量成正比關(guān)系，因此準??確性也非常高。ＴａｑＭａｎ探針被用作基因含量的精確檢測（精確度可達幾十個拷貝）??及表達變化的精確分析（精確度可達０．１倍的變化）。??Ｐｒｉｍｅｒ??！．熱－＿?錢離?Ａ＂???；?？?？?ｌ?ｔ?Ｉ????ｔ?Ｉ??２．

圖１－３?ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ染料檢測原理圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｐｒｉｎｃｉｎｐｌｅ?ｏｆ?ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ?ｄｙｅ??－ＰＣＲ過程中，熒光信號可以被探測器即時捕獲，ＲＴ－ＰＣＲ儀通曲線，在電腦生成擴增曲線，以表示在整個反應(yīng)過程中積累ＰＣＲ反應(yīng)的基線一般是ＰＣＲ的第３￣１５個循環(huán)時的熒光信號水段，此時的熒光信號變化極小，為熒光本底信號（ｂａｓｅｌｉｎｅ）。反應(yīng)的背景，可以消除擴增早期的背景影響。ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)的，ＲＴ－ＰＣＲ儀軟件通常自動將閾值設(shè)置為基線熒光值標準差的水平較基線信號水平有顯著的增加。設(shè)置閾值的意義在于，從背景中區(qū)分出來。循環(huán)閾值（Ｃｙｃｌｅ?ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，Ｃｔ）是在ＰＣ的熒光信號達到閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)，反映在圖１－４號與閾值交叉的循環(huán)數(shù)。Ｃｔ值在指數(shù)擴增的起始階段進行檢測呈反比，起始拷貝數(shù)越多，Ｃｔ值就越�。环粗�，模板起始量越此，Ｃｔ值可以被用來計算起始ＤＮＡ的拷貝數(shù)［９９＇｜（）（）１。??

在ＲＴ－ＰＣＲ過程中，熒光信號可以被探測器即時捕獲，ＲＴ－ＰＣＲ儀通過繪制熒光??與循環(huán)數(shù)曲線，在電腦生成擴增曲線，以表示在整個反應(yīng)過程中積累的產(chǎn)物（圖??１－４）。ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)的基線一般是ＰＣＲ的第３￣１５個循環(huán)時的熒光信號水平，處于背??景信號階段，此時的熒光信號變化極小，為熒光本底信號（ｂａｓｅｌｉｎｅ）。熒光本底信??號相當(dāng)于反應(yīng)的背景，可以消除擴增早期的背景影響。ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)的閾值位于指??數(shù)擴増期，ＲＴ－ＰＣＲ儀軟件通常自動將閾值設(shè)置為基線熒光值標準差的１０倍，因此??閾值信號水平較基線信號水平有顯著的增加。設(shè)置閾值的意義在于，它可將相關(guān)??擴增信號從背景中區(qū)分出來。循環(huán)閾值（Ｃｙｃｌｅ?ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，Ｃｔ）是在ＰＣＲ過程中，??擴增產(chǎn)物的熒光信號達到閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)，反映在圖１－４中即為反應(yīng)??的熒光信號與閾值交叉的循環(huán)數(shù)。Ｃｔ值在指數(shù)擴增的起始階段進行檢測，Ｃｔ值與起??始拷貝量呈反比，起始拷貝數(shù)越多，Ｃｔ值就越��；反之，模板起始量越低，Ｃｔ值就??越高。因此，Ｃｔ值可以被用來計算起始ＤＮＡ的拷貝數(shù)［９９＇｜（）（）１。??７Ｊ??三．?（??
【參考文獻】

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本文編號：2860342