肽聚糖識別蛋白作為一類可識別肽聚糖和含肽聚糖病原菌的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRR),在先天免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要的識別作用和調(diào)節(jié)功能。本實(shí)驗(yàn)克隆了三角帆蚌HcPGRP short、HcPGRP long、HcPGRP S2基因的cDNA全長序列,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測三角帆蚌三個(gè)基因在三角帆蚌血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、閉殼肌、外套膜等五種不同組織中的表達(dá),通過PBS、肽聚糖、嗜水氣單胞菌的刺激誘導(dǎo)蚌后,檢測三個(gè)基因在蚌的血細(xì)胞、肝胰腺、鰓組織中表達(dá)變化。用基因重組技術(shù)構(gòu)建pET30-HcPGRP long及pET30-HcPGRP S2原核表達(dá)載體,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)并純化出蛋白。HcPGRP short基因的全長為1493 bp,開放閱讀框?yàn)?58 bp,編碼了 285個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),其中包含5' UTR(非編碼區(qū))的長度為127 bp,3' UTR長度為508bp;HcPGRP long基因的全長為1200 bp,開放閱讀框?yàn)?62 bp,編碼了 154個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),其中包含5' UTR的長度為334bp,3' UTR長度為404bp;HcPGRP S2基因的全長為1037bp,開放閱讀框?yàn)?57 bp,編碼了 219個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),其中包含5' UTR的長度為287bp,3' UTR長度為93bp。這三個(gè)基因都含有II型N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶結(jié)構(gòu)域,也稱為PGRP結(jié)構(gòu)域。HcPGRP short和HcPGRP S2在蛋白N端都含有信號肽(HcPGRP short:MAALHITTSMSRASVLTAYRLFICFVCARCLLRNVNG;HcPGRP S2:MFQSSFRRLELNCHEPEEITMWLLFLVTLCVLSCEG)和潛在的N-糖基化位點(diǎn)(HcPGRP short:40(NPTH)和 92(NYSC);HcPGRP S2:44(NVTL));HcPGRP short 和 HcPGRP long 都含有跨膜結(jié)構(gòu)域,預(yù)測 HcPGRP short為分泌型的跨膜蛋白,HcPGRP long為跨膜蛋白,HcPGRP S2為分泌型蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示三角帆蚌這三個(gè)基因與夏威夷短尾魷魚EsPGRP4聚為一枝,表明他們之間進(jìn)化關(guān)系密切。多重序列比對顯示,HcPGRP short和HcPGRP long中能與Zn2+結(jié)合及維持酰胺酶活性位點(diǎn)只有部分保守,HcPGRP S2則高度保守;HcPGRP short和HcPGRP long中能與DAP型PGN特異性結(jié)合的三個(gè)氨基酸位點(diǎn)高度保守,而HcPGRP S2部分保守。使用熒光定量PCR檢測到三個(gè)基因在三角帆蚌不同組織中均有表達(dá),且表達(dá)量大小有相同的趨勢,表達(dá)量由高到低依次為肝胰腺、鰓、外套膜、閉殼肌、血細(xì)胞。其中HcPGRP short在肝胰腺的表達(dá)量為血細(xì)胞的6.61倍;HcPGRP long在肝胰腺的表達(dá)量為血細(xì)胞的11.29倍;HcPGRP S2在肝胰腺的表達(dá)量為血細(xì)胞的4.95倍,而HcPGRP long在各組織的表達(dá)量均是這三個(gè)基因中最低的。經(jīng)肽聚糖和嗜水氣單胞菌刺激后,除了 HcPGRP long基因在血細(xì)胞中無顯著的表達(dá)差異,這三個(gè)基因各自在血細(xì)胞、肝胰腺和鰓各組織中都有表現(xiàn)出顯著或極顯著的表達(dá)差異。這三個(gè)基因通過嗜水氣單胞菌刺激后分別在這三個(gè)組織中的某時(shí)刻表達(dá)量都表現(xiàn)出顯著或極顯著高于PBS刺激,而通過肽聚糖刺激后只在部分組織出現(xiàn)表達(dá)量顯著高于PBS刺激。通過質(zhì)粒 pET-30 建立重組質(zhì)粒 pET30-HcPGRP long 和 pET30-HcPGRP S2在誘導(dǎo)破碎后發(fā)現(xiàn)以包涵體的形式存在,HcPGRP S2的包涵體經(jīng)變性復(fù)性后純化得到了有活性的可溶性重組蛋白,HcPGRP long經(jīng)變性后純化得到可溶性重組蛋白。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

?直接相連，而Ｌｙｓ型ＰＧＮ肽橋的變化較多，前后兩肽尾Ｄ－Ａｌａ與Ｌ－ｌｙｓ中間連??有一段細(xì)菌之間所特異的間橋肽（ｉｎｔｅｒｐｅｐｔｉｄｅ?ｂｒｉｄｇｅ）（圖１．１）。除了這些分??類根據(jù)外，ＰＧＮ結(jié)構(gòu)的多樣性也與ＰＧＮ的交聯(lián)程度的差異相關(guān)［１（）］［１２］［１３］。??（？）?ｗ??Ｈ０Ｈ２Ｃ?ＨＯＨ２Ｃ??ＮＨ?｜?ＮＨ?ＨＣ－－Ｃｈ３?｜??ＣＯ?Ｉ?＊?ＣＯ??？°?？°?Ｉ?？°?ｆ°?Ｉ??ｔ．?ＣＨａ?Ｉ?ＣＨ３??Ｌ?ＣＨ３?卞?」ｎ?Ｌ?ＣＨ３?卞?３ｎ??ｏ－ｉＳ｜－ＧＪｎ?ｏ－ｉｓ｜－Ｇｌｕ??ｉ－＇ｙｓ?＊？—（ｎ?ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄｓ）?—ｏ－Ａｌａ?ｍ－ｐａｐ－＊?ｏＡｌａ??ｏ－Ａｆａ?ｔ？Ｌｙｓ?〇－Ｍａ?ｎｖＤａｐ??ｏ－ｉｓｐ－ＧＩｎ?ｏ－ｔｓｐ－Ｇｌｕ??ｔ＾ａ?ｔ－Ｍａ??ｔ?ｔ???ＧＩｃＮＡｃ?｜Ｍ．４?ＭｕｒＮＡｃ￣－?—??ＧＩｃＮＡｃ?１＞－１，４?ＭｕｒＮＡｃ＊——?＿??Ｊｎ?Ｊｎ??圖１．１?Ｌｙｓ型和Ｄａｐ型ＰＧＮ結(jié)構(gòu)示意圖??圖１．１?Ｌｙｓ和Ｄａｐ型ＰＧＮ結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇ?１．１?Ｓｔｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?Ｌｙｓ－ｔｙｐｅ?ａｎｄ?Ｄａｐ－ｔｙｐｅ?ＰＧＮ??ＰＧＮ作為細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分重要而獨(dú)特，主要存在于革蘭氏陽性細(xì)菌??中［１２］，在細(xì)菌的生存中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它是很多臨床上所用的抗生素??的作用靶標(biāo)，它以阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁的合成來達(dá)到抑菌效果［１２］，而ＰＧＮ是所有細(xì)??菌特有的成分而不存在于真核細(xì)胞中

液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為２００?ｒｐｍ溫度為３７?°Ｃ振蕩８ｈ，同樣方法再進(jìn)行擴(kuò)大培??養(yǎng)，然后用普通質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。載體的多克隆位點(diǎn)的序列和結(jié)構(gòu)圖??譜如圖２．３。??回收產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴ３０－ａ?（＋）分別用限制性內(nèi)切酶ＨｃＰＧＲＰＳ２：?Ｋｐｎｌ??和ＥｃｏＲＩ；?ＨｃＰＧＲＰ?ｌｏｎｇ：?ＥｃｏＲＩ和Ｘｈｏｌ）進(jìn)行雙酶切，酶切體系為２〇ｎＬ?（１０吣??ＤＮＡ或質(zhì)粒，６吣Ｈ２０，?２ｍＬｌ〇ｘＨ?ｂｕｆｆｅｒ，限制性內(nèi)切酶各為ｌｊｉＬ），３７°Ｃ?４ｈ。??酶切后分別對酶切產(chǎn)物用普通ＤＮＡ產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。??將兩種酶切產(chǎn)物用Ｔ４ＤＮＡ連接酶進(jìn)行連接，為ＩＯｊｉＬ的連接體系，包括：??４ｐＬＤＮＡ，４吣質(zhì)粒，ｌｐＬＴ４ＤＮＡ連接酶，１吣連接ｂｕｆｆｅｒ，放于４°Ｃ冰箱中??連接過夜。次日取連接產(chǎn)物５叫轉(zhuǎn)化至ＤＨ５ａ感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板后培養(yǎng)，??約１０ｈ后挑取單個(gè)菌落，ＰＣＲ檢測后取陽性菌液５００１ｎＬ送測。??按１：?５０的比例將測序正確的菌液加入到Ｋａｎａ＋?ＬＢ培養(yǎng)基擴(kuò)培，３７°Ｃ，??２００ｒｐｍ振蕩培養(yǎng)８ｈ

３．２基因的ｃＤＮＡ全長及氨基酸序列??３．２．１?ＨｃＰＧＲＰ?ｓｈｏｒｔ基因的ｃＤＮＡ序列及推導(dǎo)的氨基酸序列??ＨｃＰＧＲＰ?ｓｈｏｒｔ核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖３．２，其全長為１４９３?ｂｐ，??開放閱讀框長度為８５８ｂｐ，編碼的蛋白質(zhì)是由２８５個(gè)氨基酸組成，其中包含３’??１１〇１長度為５（＾？，５’１１�。保保ǚ蔷幋a區(qū)）長度為１２７?５？；含有多聚腺苷酸尾０〇以??（Ａ）和１個(gè)ＡＡＴＡＡ加尾信號；并在該蛋白Ｎ端有一個(gè)長度為３７個(gè)氨基酸的??信號肽（ＭＡＡＬＨＩＴＴＳＭＳＲＡＳＶＬＴＡＹＲＬＦＩＣＦＶＣＡＲＣＬＬＲＮＶＮＧ）。該蛋白分子??量為３２．３３ｋＤ，理論等電點(diǎn)為７．９８，１１個(gè)半胱氨酸殘基存在于氨基酸序列中。??ＮｅｔＮＧｌｙｃ預(yù)測三角帆蚌ＰＧＲＰ?ｓｈｏｒｔ含有兩個(gè)潛在的Ｎ－糖基化位點(diǎn)為４０??（ＮＰＴＨ）和９２?（ＮＹＳＣ）。Ｐｆａｍ?ＨＭＭ分析其蛋白序列，發(fā)現(xiàn)在Ｃ端于１２５－２６１??氨基酸位點(diǎn)存在長度為１３７個(gè)氨基酸的ＩＩ型Ｎ－乙酰胞壁酸－Ｌ－丙氨酸酰胺酶結(jié)構(gòu)??域，也稱為ＰＧＲＰ結(jié)構(gòu)域。??１?ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧ??６１?ＧＣＴＧＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＴＣＧＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＴＡＡＧＡＣＡＴＣＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＣＧＣＡＴＴ??１２１?ＧＡＧＣＴＴＡ＾ＧＣＧＧＣＣＴＴＡＣＡＴＡＴＡＡＣＣＡＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＧ
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本文編號：2860412