運(yùn)動(dòng)性對(duì)于病原菌成功入侵宿主、定殖、并在宿主體內(nèi)釋放毒力因子具有重要作用,因此細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性是一個(gè)新型藥物篩選潛在的靶標(biāo)。在木研究中,從雅浦海溝附近海域分離到了一株海洋溶藻弧菌Vibrio alginolyticus 178,該菌具有強(qiáng)烈的運(yùn)動(dòng)能力且對(duì)斑馬魚(yú)魚(yú)有高致病性。以溶藻弧菌V. alginolytious 178作為對(duì)象,利用對(duì)峙培養(yǎng)法從相同生態(tài)位篩選得到一株抑制溶藻弧菌V.alginolyticus178運(yùn)動(dòng)的海洋細(xì)菌芽孢桿菌Bacillus sp. 176。采用鹽酸沉淀、凝膠過(guò)濾層析、高效液相色譜等方法從芽孢桿菌Bacillus sp. 176的發(fā)酵液中分離得到了兩個(gè)活性物質(zhì)(CLP1和CLP2),運(yùn)用氨基酸分析、質(zhì)譜和核磁共振波譜的技術(shù)方法鑒定了這兩個(gè)活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)活性物質(zhì)是pumilacidin類(lèi)的脂肽,分子量在脂肪鏈上相差一個(gè)亞甲基。除了能夠抑制溶藻弧菌V.alginolyicus 178的運(yùn)動(dòng)外,活性脂肽(CLPs)能夠明顯降低溶藻弧菌對(duì)斑馬魚(yú)魚(yú)的致病性,誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞的聚集沉降,并且降低溶藻弧菌V.alginolyticus 178在玻片上的黏附能力。此外,活性脂肽能夠抑制其它病原菌生物膜的形成而不殺死病原菌。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)脂肽處理后,溶藻弧菌V.alginolyticus178的兩個(gè)鞭毛合成組裝基因(flgA和flgP)轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。本研究表明芽孢桿菌Bacillus sp. 176產(chǎn)生的活性脂肽能夠抑制溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性,具有作為新型抗菌先導(dǎo)化合物的潛力,靶向細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和生物膜的形成而不產(chǎn)生抗生素耐性。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：S941.4
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 弧菌
        1.1.1 溶藻弧菌的生物學(xué)特性
        1.1.2 溶藻弧菌的致病性與毒力因子
            1.1.2.1 黏附素
            1.1.2.2 外膜蛋白
            1.1.2.3 胞外產(chǎn)物
            1.1.2.4 脂多糖
            1.1.2.5 鐵吸收系統(tǒng)
        1.1.3 弧菌病
        1.1.4 拮抗菌及其代謝產(chǎn)物抗弧菌研究
    1.2 鞭毛
        1.2.1 鞭毛細(xì)絲
        1.2.2 鞭毛基體
        1.2.3 鞭毛馬達(dá)
        1.2.4 FlgA和FlgP蛋白
        1.2.5 FlhG和FlhF蛋白
        1.2.6 鞭毛組裝
        1.2.7 鞭毛的基因調(diào)控
    1.3 芽孢桿菌脂肽
        1.3.1 芽孢桿菌脂肽的研究概況
            1.3.1.1 伊枯草菌素家族Iturins
            1.3.1.2 芬薺素家族Fengycins
            1.3.1.3 表面活性素家族Surfactins
        1.3.2 芽孢桿菌脂肽的分離與鑒定研究
            1.3.2.1 脂肽的定性檢測(cè)
            1.3.2.2 脂肽的純化與鑒定
    1.4 本論文研究目的與意義
第二章 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 菌株
    2.2 培養(yǎng)基
    2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
第三章 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 溶藻弧菌的分離與鑒定
    3.2 溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性
    3.3 溶藻弧菌的致病性
    3.4 菌株的分離、篩選與鑒定
        3.4.1 菌種庫(kù)的擴(kuò)充
        3.4.2 活性菌株的篩選
        3.4.3 菌株的鑒定
    3.5 活性物質(zhì)的發(fā)酵優(yōu)化及性質(zhì)確定
        3.5.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化
        3.5.2 活性物質(zhì)類(lèi)型性質(zhì)的確定
    3.6 活性物質(zhì)的分離純化
        3.6.1 菌株規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)
        3.6.2 粗提物的制備
        3.6.3 Sephadex LH-20凝膠過(guò)濾層析
        3.6.4 HPLC分離純化
    3.7 活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定
        3.7.1 活性物質(zhì)的氨基酸分析
        3.7.2 活性物質(zhì)的質(zhì)譜分析
        3.7.3 活性物質(zhì)的核磁共振波譜分析
    3.8 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的影響
        3.8.1 平板抑制實(shí)驗(yàn)
        3.8.2 生長(zhǎng)狀態(tài)曲線
    3.9 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌致病性的影響
    3.10 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌的聚集作用
        3.10.1 聚集效應(yīng)
        3.10.2 溶藻弧菌形態(tài)變化
    3.11 活性物質(zhì)對(duì)其他細(xì)菌聚集和生物膜的影響
    3.12 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌黏附能力的影響
    3.13 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌鞭毛形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響
        3.13.1 細(xì)菌總RNA提取
        3.13.2 cDNA合成
        3.13.3 qRT-PCR定量
第四章 結(jié)果與討論
    4.1 溶藻弧菌的分離與鑒定
    4.2 溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性
    4.3 溶藻弧菌的致病性
    4.4 菌株的分離、篩選與鑒定
        4.4.1 菌株的分離
        4.4.2 抑制運(yùn)動(dòng)性的篩選
        4.4.3 活性菌株的鑒定
    4.5 活性物質(zhì)的發(fā)酵優(yōu)化及性質(zhì)確定
        4.5.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化
        4.5.2 活性物質(zhì)類(lèi)型性質(zhì)的確定
    4.6 活性物質(zhì)的分離純化
        4.6.1 活性物質(zhì)的發(fā)酵和粗提物制備
        4.6.2 Sephadex LH-20凝膠過(guò)濾層析
        4.6.3 HPLC分離純化
    4.7 活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定
        4.7.1 活性物質(zhì)的氨基酸分析
        4.7.2 活性物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜分析
        4.7.3 活性物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜分析
        4.7.4 活性物質(zhì)的核磁共振波譜分析
    4.8 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性的影響
    4.9 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌致病性的影響
    4.10 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌的聚集沉降
        4.10.1 聚集效應(yīng)
        4.10.2 溶藻弧菌形態(tài)變化
    4.11 活性物質(zhì)對(duì)其他細(xì)菌聚集和生物膜的影響
    4.12 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌黏附能力的影響
    4.13 活性物質(zhì)對(duì)溶藻弧菌鞭毛形成相關(guān)基因表達(dá)的影響
    4.14 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄 1
致謝
作者簡(jiǎn)歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

【參考文獻(xiàn)】

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