發(fā)布時間：2020-10-26 17:11

　　 嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是水產養(yǎng)殖中一種較常見的條件致病菌,給我國淡水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失。隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的快速增長,盲目投放抗生素的現(xiàn)象已經屢見不鮮。研究表明化學抗生素會導致細菌耐藥性增加,同時抗生素會在魚體內殘留從而對水產品安全造成隱患,使用疫苗對魚病進行免疫防控是今后的發(fā)展趨勢。但是疫苗的免疫效果受免疫方式和環(huán)境因素的影響較大,本文以異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)為研究對象,控制其浸泡免疫嗜水氣單胞菌滅活疫苗的水溫,運用免疫毒理學、生物化學和分子生物學等相關技術,初步探討了浸泡溫度對異育銀鯽免疫應答的影響。本研究將制備好的嗜水氣單胞菌滅活疫苗稀釋至1×10~8 CFU/mL,將異育銀鯽分別在20℃、25℃和30℃的疫苗中浸泡免疫30min,然后撈出正常飼養(yǎng)。免疫后的3h、12h、48h和96h取樣,用酶活測定試劑盒檢測黏液和血清中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活力。采用實時熒光定量PCR技術分析免疫應答相關基因表達情況:包括主要組織相容性復合體I(MHC I)、Toll樣受體3(TLR3)和白介素11(IL-11)在鰓、后腸和脾中的表達情況。在免疫后的5d、7d、11d、18d和25d刮取黏液和分離血清,利用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA),對免疫后黏液和血清中特異性抗體的效價進行分析。免疫后的第25天,用濃度為3.74×10~6 CFU/mL(2×LD_(50))的菌液進行攻毒實驗,計算相對免疫保護率(RPS)。主要結果如下:浸泡免疫后,血清和黏液中非特異性酶的活力都顯著升高。(1)在黏液中,LZM的活力在浸泡免疫后短時期內隨著浸泡溫度的升高,上升趨勢更加顯著,酶活力達到峰值的時間更短,但隨著時間的延長酶活力逐漸降低,最終趨于穩(wěn)定。SOD、AKP和ACP的活力呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢,在12h和48h之間酶活力達到峰值,同樣隨著浸泡溫度的升高酶活力達到峰值的時間更短。(2)血清中,LZM的活力在各個溫度浸泡組中無顯著差異,直到96h各組酶的活力才顯著增加。SOD的活力在30℃處理組達到峰值的時間更短,另外兩組在12h左右達到峰值,隨后出現(xiàn)穩(wěn)定降低的趨勢。AKP和ACP的活力在浸泡免疫后3h急劇上升,隨后又恢復至正常水平,隨著時間的延長酶活力呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。浸泡免疫后三個基因在不同組織中表達量呈現(xiàn)不同程度的上升。在后腸中的表達量要顯著高于另外兩個組織,且受浸泡溫度的影響較大,在25℃和30℃浸泡組基因的表達要顯著高于20℃浸泡組。而在鰓和脾中基因表達的趨勢相近,受浸泡溫度的影響也不太顯著。MHC I基因的表達在浸泡免疫后12h內顯著上調,隨后出現(xiàn)基因先下調后上調的趨勢。TLR3基因的表達量隨著時間的延長先上調后下調,在鰓和后腸中峰值出現(xiàn)的時間要比脾中峰值出現(xiàn)的時間早。IL-11基因的表達量隨著時間的延長逐漸下調,在鰓中12h后基因的表達顯著低于對照組,而后腸和脾中基因表達顯著高于對照組。在30℃浸泡免疫組中,特異性抗體上升的時間更早且抗體效價也更高。以3.74×10~6 CFU/mL的菌液攻毒后進行免疫保護效果評估,結果顯示在20℃、25℃和30℃三個溫度中浸泡免疫的相對免疫保護率分別為38.9%、33.3%和50%。本文主要根據(jù)異育銀鯽在不同溫度中浸泡免疫嗜水氣單胞菌滅活疫苗后血清和黏液中非特異性酶活力及特異性抗體的變化,以及免疫相關基因的組織差異性表達,初步探討了浸泡溫度對異育銀鯽免疫應答的影響,結果顯示浸泡免疫后可以顯著增強魚體的免疫應答效應,且30℃浸泡下免疫效果更佳。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S948
【部分圖文】：

西南大學碩士學位論文3.2 實驗結果3.2.1 黏液中非特異性酶活力變化不同實驗組中，異育銀鯽黏液 LZM、SOD、AKP 和 ACP 的活力變化如圖 3-1所示。浸泡免疫后，LZM 活力在 3h 內迅速上升，與對照組相比差異顯著（P<0.05），并且隨著浸泡溫度（20℃、25℃和 30℃）的升高，LZM 的活力也顯著升高（P<0.05）。但隨著時間的延長活力逐漸降低，并于 48h 后趨于平穩(wěn)，與 20℃和 25℃處理組相比，30℃處理組的活力降低趨勢更明顯，48h 后與對照組 LZM 活力差異不顯著（P>0.05）A B

圖 3-2 異育銀鯽血清中 LZM（A）、SOD（B）、ACP（C）和 AKP（D）活力的變化Figure 3-2. The changes of activities of LZM (A), SOD (B), ACP (C) and AKP (D) in serum ofCarassius auratus gibelioC 表示對照組，不同字母表示同一時間點不同溫度浸泡組間的差異性（P<0.05）（平均值±標準誤）。C: control. Different letters denote significant differences at 0.05 levels among different temperature groups at the same time point(P<0.05). (Mean ±S.E)3.3 討論目前主要通過檢測非特異性酶活力的變化以及免疫相關基因的表達來評估疫苗的免疫效果。而影響疫苗免疫效果的因素有很多，主要包括改變疫苗浸泡的滲透壓、添加佐劑、調整最適浸泡濃度、浸泡時間以及最佳飼養(yǎng)水溫等，但是關于最佳浸泡溫度的研究卻比較少見。本章主要通過非特異性酶活性的變化，探究浸泡溫度對免疫應答的影響，因為非特異性酶除了在免疫防御中發(fā)揮重要作用以外，也對免疫效應具有指示作用。LZM 廣泛存在于魚類的體液、血清、巨噬細胞以及各種組織中，在魚類免疫防御中發(fā)揮重要作用，包括溶解細菌、調理作用及增強免疫反應等，同時也是非

西南大學碩士學位論文分析1.6結果特異性抗體水平的變化鯽經過嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡后，黏液中特異性抗體水1 所示。總體而言，各個溫度浸泡組之間趨勢相同，隨著時間平顯著增加，18d 達到峰值，之后恢復到對照組水平。但是各在差異，免疫后第 7d，30℃浸泡組特異性抗體水平開），而另外兩個溫度浸泡組與對照組相比無顯著性差異（P>0液中特異性抗體水平隨著浸泡溫度的升高而顯著增加（P<0后在 25d 時恢復到正常水平。
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