糖原合成酶激酶3β (Glycogen synthase kinase3β, GSK3β)作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與代謝反應(yīng)、Wnt、BMP/Smadl、Hedgehog以及PI3K-AKT等信號通路。GSK3β通過磷酸化一系列底物進(jìn)而調(diào)控著細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。它的紊亂導(dǎo)致睪丸退化、睪丸破裂以及其他的生殖相關(guān)疾病,最終導(dǎo)致不育。在哺乳動物中,GSK3β在精子發(fā)生過程中起著重要的作用。為了探討GSK3β在中華絨螯蟹精子發(fā)生過程中的功能,我們從中華絨螯蟹精巢中克隆了GSK3β基因的全長序列GSK3β中華絨螯蟹GSK3β基因的cDNA序列全長為1614 bp,包含一個(gè)1161 bp的開放閱讀框,可編碼386個(gè)氨基酸殘基,一個(gè)395 bp的5'非編碼區(qū)(5'UTR)和一個(gè)58 bp的3'非編碼區(qū)(3'UTR)。EsGSK3β具有S TKc催化結(jié)構(gòu)域,該氨基酸序列的功能位點(diǎn)是從第54個(gè)氨基酸到第338個(gè)氨基酸為絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。分析EsGSK3 β蛋白的功能域,顯示中華絨螯蟹GSK3β有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶的功能域(STKc_ GSK3, PKc_like superfamily),此功能域中含有axin結(jié)合位點(diǎn)(axin binding site)、活化位點(diǎn)(active site)、激活環(huán)(activation loop, A-loop)、多肽底物結(jié)合位點(diǎn)(polypeptide substrate binding site)、ATP結(jié)合位點(diǎn)(ATP binding site)。使用ClustalX軟件對GSK3β蛋白同源序列進(jìn)行多重比對分析,發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹GSK3β蛋白與其他物種的GSK3β蛋白具有高度的保守性。我們發(fā)現(xiàn)GSK3β蛋白進(jìn)化樹分為兩支,中華絨螯蟹GSK3β蛋白先和節(jié)肢動物阿里山潛蠅繭蜂聚在一起,然后再與軟體動物長牡蠣聚成一大類,形成無脊椎動物的一支,最后與脊椎動物聚在一起。由此可見GSK3β蛋白的進(jìn)化與傳統(tǒng)的分類學(xué)和進(jìn)化觀點(diǎn)一致。在核酸層面上,我們利用qPCR技術(shù),檢測了GSK3β基因在中華絨螯蟹不同組織中的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)EsGSK3β基因在中華絨螯蟹不同組織中也是廣泛表達(dá)。EsGSK3β在副性腺中表達(dá)量最高,其次在卵巢中表達(dá)量相對較高,按照在剩余的組織中表達(dá)水平依次降低的順序?yàn)椋何�、心臟、精巢、腸、鰓。GSK3β蛋白水平的表達(dá)與GSK3β基因水平的表達(dá)情況基本類似。接著我們檢測到EsGSK3β基因在中華絨螯蟹精巢發(fā)育過程中都有表達(dá),在七月和八月中,EsGSK3β基因的表達(dá)量相對較高；在九月、十月和十一月中,EsGSK3β基因的表達(dá)量最低且基本一致；在十二月和次年一月中,EsGSK3β基因的表達(dá)量顯著高于其他月份。為了進(jìn)一步了解EsGSK3β蛋白在中華絨螯蟹精巢不同發(fā)育階段的表達(dá)情況,我們利用Western blotting技術(shù)對EsGSK3β蛋白分布特征進(jìn)行分析。我們檢測到在中華絨螯蟹精巢不同發(fā)育階段,EsGSK3β蛋白的表達(dá)水平和EsGSK3β基因的表達(dá)水平不一致。EsGSK3β蛋白在七月、八月的表達(dá)量最高,在九月的表達(dá)量相對較高,在十月、十一月、十二月和次年一月的表達(dá)量最低,且在后面的四個(gè)月份中表達(dá)水平無顯著的差異。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步的分析了GSK3β基因和蛋白在中華絨螯蟹精巢發(fā)育過程中的分布情況。原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中,EsGSK3β基因主要分布的細(xì)胞質(zhì)中,只有一少部分分布在細(xì)胞核中；在成熟的精子中,EsGSK3β基因主要存在于頂體管和頂體帽中。免疫熒光結(jié)果顯示盡管在精原和精母細(xì)胞的細(xì)胞核中檢測到少量的陽性信號,但EsGSK3β蛋白主要從精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到精細(xì)胞的頂體囊中,最后轉(zhuǎn)到精子的頂體管和頂體帽中。因此,通過本研究,我們推測EsGSK3β在中華絨螯蟹精子發(fā)生過程中起著重要的角色。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    第一節(jié) GSK3β簡介
    第二節(jié) GSK3β的研究現(xiàn)狀
    第三節(jié) 本研究的目的、意義和技術(shù)路線
第二章 中華絨螯蟹GSK3β基因全長克隆及序列分析
    1. 材料與方法
    2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3. 討論
第三章 中華絨螫蟹GSK3β基因和蛋白在不同組織和精巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析
    1. 材料與方法
    2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3. 討論
第四章 中華絨螯蟹GSK3β基因和蛋白的定位分析
    1. 材料與方法
    2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3. 討論
第五章 總結(jié)及展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

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本文編號：2856901