長牡蠣(Crassostrea gigas),生活于潮間帶,是全世界重要的水產養(yǎng)殖種類之一。由于其特殊的生態(tài)位和較高的經濟價值,長牡蠣已成為冠輪動物中得以研究最多的物種之一。在長牡蠣中研究甲狀腺激素及其信號通路關鍵基因不僅有助于加深了解冠輪動物,也為解析無脊椎動物和脊椎動物的內分泌系統(tǒng)進化過程、促進牡蠣產業(yè)技術進步提供寶貴的科學信息。本論文的研究內容包括三大塊,主要內容和結論如下:1長牡蠣甲狀腺激素及其信號通路關鍵基因的功能研究上個世紀,甲狀腺激素(THs,包含T4和T3)被認為只在脊椎動物中發(fā)揮作用。近些年,越來越多的證據(jù)表明,THs也存在于頭索和尾索動物中。然而,目前THs相關的研究在非脊索的無脊椎動物還很少見。為了研究THs的起源與進化,我們選擇了冠輪動物的代表—牡蠣為研究對象,通過生理和分子兩種手段探討牡蠣中的THs系統(tǒng)。本研究用高效液相色譜法和液相色譜與質譜串聯(lián)的方法定性的檢測了T4和T3的存在,又用電化學免疫法定量檢測了牡蠣發(fā)育過程中THs的變化。使用分子手段克隆了一些THs信號通路中的關鍵基因,包括4個合成酶甲狀腺過氧化物酶(PERT),2個代謝酶脫碘酶,一個甲狀腺激素受體(TR)。使用熒光定量分析、免疫印跡分析、亞細胞定位、原核表達、酵母雙雜交、凝膠遷移電泳(EMSA)、雙報告基因技術等一系列分子生物學實驗技術,對這些基因進行了功能鑒定。實驗數(shù)據(jù)證明,在牡蠣中也存在甲狀腺激素及其信號通路。THs可能參與胚胎形成,生長和變態(tài)等一些發(fā)育過程。牡蠣胚胎可能通過CgPERT1自體合成THs。牡蠣胚胎可以在體內將T4轉化為T3,這項功能可能是由脫碘酶基因(CgDx或CgDy)行使的。CgDx和CgDy的mRNA表達受到THs和CgTR的調控,它們的啟動子區(qū)域含有TRE。THs可能通過CgTR與TRE結合來調控CgDx和CgDy的轉錄。這些實驗證據(jù)說明TH系統(tǒng)的反饋調節(jié)機制在牡蠣中也是存在的。CgTR能通過與目的基因的啟動子區(qū)域結合來調控基因的表達,并能與視黃酸X受體(CgRXR)發(fā)生相互作用。CgTR mRNA的表達受到T4和CgTR蛋白的調控,且在CgTR的啟動子區(qū)域找到了一個甲狀腺激素效應元件(TRE)。這些CgTR的功能與脊椎動物的TR一致,說明這些功能在TR的共同祖先中已經存在。然而,CgTR的DNA結合特性和轉錄激活活性并不保守。與血吸蟲的TR相似,CgTR能與DR0-DR5結合。此外,兩種雙報告實驗證明CgTR的轉錄激活活性不能被T4,T3或TRIAC激活。這些不保守的功能將為TR功能乃至TH系統(tǒng)的進化提供寶貴的線索。這是首次在無脊椎動物中系統(tǒng)地研究THs的生理作用和分子機理。根據(jù)本研究獲得的結果,我們認為THs及其信號通路在牡蠣中是存在的,可將THs的起源追溯至冠輪動物。2視黃酸X受體RXR的功能研究本研究克隆獲得了牡蠣中唯一的RXR基因CgRXR。該基因在胚胎發(fā)育過程中表達量較高,說明可能參與到牡蠣的胚胎發(fā)育過程。該基因定位于細胞核,為其作為轉錄因子調控基因表達提供空間便利。通過熒光雙報告實驗證明CgRXR的轉錄激活活性可以被9-cis RA、DHA激活,說明CgRXR LBD的結合功能是保守的。CgRXR的轉錄激活活性也可以被環(huán)境污染物三丁基錫(TBT)、三苯基錫(TPT)激活,說明有機錫污染物對牡蠣的毒害作用可能是通過RXR來介導的。EMSA實驗結果表明,CgRXR能與DR0-DR5結合,除了與DR4結合較弱外,與其余的探針結合能力相當。雙殼類RXR的DNA結合特性不保守,與脊椎動物和腹足類的均有較大差異。3新的核受體亞家族NR8的進化分析和CgNR8A1的功能研究核受體(NR)屬于轉錄因子超級族,它通過調節(jié)基因表達來調控后生動物的發(fā)育、內穩(wěn)態(tài)、分化和繁殖等。近幾年,迅速發(fā)展的基因組計劃為核受體的進化和功能研究提供了新的機遇。具有典型結構的核受體被分為6個亞家族。本研究在長牡蠣中克隆了一個具有典型結構的核受體(CgNR8A1)。然而進化分析發(fā)現(xiàn)該基因不能歸類于現(xiàn)有的NR亞家族。通過數(shù)據(jù)挖掘,我們在后生動物中(包括刺胞動物,軟體動物,環(huán)節(jié)動物,棘皮動物,半索動物和頭索動物)又找到了9個CgNR8A1的同源基因。進化分析發(fā)現(xiàn)它們組成了一個新的NR亞家族,命名為NR8亞家族。NR8是第三出現(xiàn)的NR亞家族,起源于真后生動物的共同祖先,并在脊椎動物、蛻皮動物、扁形動物的祖先中分別獨立發(fā)生了基因丟失事件。對CgNR8A1的功能研究結果表明,CgNR8A1具有核定位信號肽GKHRNKKPRLD,并定位于細胞核。發(fā)育過程中的表達模式暗示CgNR8A1可能參與胚胎的形成。EMSA實驗顯示CgNR8A1能與保守的DNA核心基序DR0、DR2、DR4緊密結合,與DR1、DR3、DR5、Half和Pal0結合較弱。新鑒定的NR8亞家族增加了人們對NR亞家族進化的理解,CgNR8A1的功能鑒定有助于對NR8亞家族功能的理解。
【學位單位】：中國科學院大學(中國科學院海洋研究所)
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

第一章、文獻綜述這段短序列組成了一個非對稱的二聚接口，并且它的氨基酸序列對區(qū)分不同的DRs 有著非常重要的作用(Bourguet, Ruff et al. 1995, Knegtel, van Tilborg et al.1995)。在 DBD 和 LBD 之間的序列最初被認為是多變的鉸鏈區(qū)。更加細致的分析該區(qū)域發(fā)現(xiàn)很多 NRs 都含有核受體定位信號肽段。該區(qū)域中與 DBD 和 LBD 銜接的末端也是高度保守的。如，N 端的 T-box 和 A-box 分別參與 NRs 的二聚化和 half-site 的識別。C 端含有的結構域在配體介導的受體與轉錄調節(jié)因子的結合，特別是行駛轉錄抑制是，起關鍵作用。鉸鏈區(qū)的突變與腫瘤生成相關，說明該區(qū)域的作用曾被低估了(Bourguet, Ruff et al. 1995)。

兩條 GSP 引物進行擴增。第一輪擴增使用 LaTaq 反應體系和 touchdown 反應程序如下：touchdown 反應程序：94°C 3 min94 °C 30 sTM+2 30 s72 °C 1kb/min94 °C 30 sTM-3 30 s72 °C 1kb/min72 °C 10 min4°C 保溫第二輪擴增模板使用稀釋了 50 倍的第一次 PCR 產物，LaTaq 反應體系和 LaTaq反應程序。PCR 產物的純化，連接轉化，測序同基因片段的克隆。20 cysles10 cysles, - 0.7°C/cycle

第二章、長牡蠣甲狀腺激素及其信號通路關鍵基因的功能研究然后進行 5’加尾反應。以末端轉移酶（TdT）為 cDNA 加尾。5’加尾反應體系：cDNA 10 μldCTP 0.5 ul5×TdT 緩沖液 5.0 ulBSA 緩沖液 6.25 ul滅菌超純水 2.25 ul反應程序為：94℃冰上放置 3min，，加入 TdT 1μl，混勻 37℃水浴 15min 后，再 65℃水浴 5min，-20℃保存。以 5’加尾后的 cDNA 為模板，用 oligo(dG)-AP 和 AP 引物以及目的基因的兩條 GSP 引物進行巢式 PCR 擴增。第一輪和第二輪的反應體系和反應程序及后續(xù)的操作都同 3’RACE。
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本文編號：2854795