軟體動(dòng)物性腺分化與發(fā)育的分子機(jī)制一直以來都是繁殖生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)的研究重點(diǎn)。盡管軟體動(dòng)物體內(nèi)存在類似于脊椎動(dòng)物的雌激素和雄激素,但由于缺乏對(duì)其生物合成途徑或來源的了解,以及有關(guān)激素受體的直接證據(jù),脊椎動(dòng)物類型的類固醇激素在軟體動(dòng)物性腺分化中的作用尚無定論。近年來,備受關(guān)注的腹足類性畸變分子機(jī)制的研究表明,維甲酸X受體(retinoid X receptor,RXR)在腹足類性畸變的過程起著重要的作用。有關(guān)性畸變分子機(jī)制的研究表明RXR對(duì)于腹足類性腺分化與發(fā)育的作用機(jī)制至關(guān)重要。本論文采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和RNA干擾技術(shù)研究了雜色鮑RXR基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因在雜色鮑性腺分化與發(fā)育中的作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:1、每月采集雌雄樣品,采用常規(guī)組織切片和HE染色技術(shù)跟蹤觀察了雜色鮑性腺發(fā)育的周年變化。根據(jù)雜色鮑性腺的顏色、體積、生殖細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及占主體的生殖細(xì)胞的類型等將雜色鮑的性腺發(fā)育分為5個(gè)時(shí)期:休止期、增殖期、生長(zhǎng)期、成熟期和排放期。觀察結(jié)果顯示:廈門本地的雜色鮑一年只有一個(gè)生殖周期,并且雌性個(gè)體和雄性個(gè)體的發(fā)育是不同步的:雌性雜色鮑性腺發(fā)育的休止期是1到3月;增殖期是4到5月;生長(zhǎng)期是6到7月;成熟期是8到12月,雄性雜色鮑性腺發(fā)育的休止期是2到3月;增殖期是4到5月;生長(zhǎng)期是6到10月;成熟期是11月到次年1月。另外,雜色鮑性腺發(fā)育的個(gè)體差異較大,性腺發(fā)育成熟時(shí)期會(huì)觀察到處于生長(zhǎng)期或者更早期的個(gè)體,因此不同發(fā)育時(shí)期樣品的選擇要根據(jù)組織學(xué)觀察的結(jié)果而不是取樣的時(shí)間。2、采用geNorm、Normfinder和Bestkeeper等內(nèi)參分析軟件對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因包括β-action(β-ACT)、18S ribosomal(18S)、28S ribosomal(28S)、elongation factor 1-alpha(ELFA)、ribosomal protein L8(RPL8)、translation initiation factor 5A(EIF5A)、Y-box protein(YB1)、ornithine decarboxylase antizyme 1(OAZ1)、60S ribosomal protein L3(RPL3)、ribosomal protein S9(RPS9)進(jìn)行分析并篩選了雜色鮑性腺發(fā)育過程中不同組織的最適內(nèi)參基因:雜色鮑性腺發(fā)育過程中卵巢內(nèi)表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是OAZ1;雜色鮑性腺發(fā)育過程中雌性雜色鮑頭部組織內(nèi)表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是EIF5A;雜色鮑性腺發(fā)育過程中雌性雜色鮑肝胰腺組織內(nèi)表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是28S;雜色鮑性腺發(fā)育過程中雄性雜色鮑頭部組織內(nèi)表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是RPS9;雜色鮑性腺發(fā)育過程中雄性雜色鮑肝胰腺組織內(nèi)表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是EIF5A。3、分析了維甲酸X受體(retinoid X receptor,RXR)在雜色鮑性腺發(fā)育過程中不同組織的表達(dá)情況:在卵巢、雌性個(gè)體頭部、雌性個(gè)體肝胰腺和雄性個(gè)體頭部組織中,RXR在性腺發(fā)育的增殖期時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05);在雄性個(gè)體肝胰腺組織中RXR在性腺發(fā)育的增殖期時(shí)的表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.05)。結(jié)果顯示,RXR基因在性腺發(fā)育增殖期時(shí)的不同組織的表達(dá)量與其他發(fā)育時(shí)期相比均存在顯著性差異,這表明增殖期是RXR在雜色鮑性腺分化與發(fā)育發(fā)揮作用的窗口期。4、本論文還通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因在雜色鮑性腺分化與發(fā)育中的作用:在卵巢中,半胱天冬氨酸酶3(Caspase3,Casp3)和細(xì)胞凋亡因子(defender against cell death 1,DAD1)在性腺發(fā)育休止期時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05);類胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)和轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein 1,AP1)在性腺發(fā)育增殖期時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05),表明Casp3、DAD1、IGFBP7和AP1確實(shí)參與了卵巢分化與發(fā)育過程。5、雌性雜色鮑肝胰腺組織注射RXR基因雙鏈RNA 48h后,雌性雜色鮑頭部組織的RXR表達(dá)量與空白對(duì)照組和綠色熒光對(duì)照組相比沒有顯著性差異;雌性雜色鮑卵巢組織的RXR表達(dá)量空白對(duì)照組和綠色熒光對(duì)照組相比顯著性下調(diào)。這些結(jié)果證明了對(duì)雜色鮑進(jìn)行活體注射雙鏈RNA可以讓體內(nèi)的目的基因產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。
【學(xué)位單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

(c) 生長(zhǎng)期 (d) 成熟期圖 2.1 雄性雜色鮑性腺發(fā)育分期Fig 2.1 Photomicrographs of H.diversicolor developmental stages of the testis2.2.2 卵巢發(fā)育的分期卵巢組織處于休止期時(shí)卵巢萎縮，生殖上皮隨結(jié)締組織遷移到卵巢腔內(nèi)，腔體積較腔內(nèi)觀察不到生殖細(xì)胞，但有一定數(shù)量的濾泡細(xì)胞（圖 3.2a）。增值期的卵巢中，性腺腔積變化不大，腔內(nèi)的生殖上皮分化出大量的卵原細(xì)胞并貼壁分布，形成增值中心，腔壁結(jié)締組織發(fā)達(dá)（圖 3.2b）卵巢發(fā)育至生長(zhǎng)期時(shí)卵巢體積變大，單個(gè)的生殖細(xì)胞體積也迅的增大，但仍殘留少量的早期生殖細(xì)胞，腔壁明顯變�。▓D 3.2c）。卵巢成熟時(shí)期，整個(gè)巢被成熟的卵母細(xì)胞所填充，細(xì)胞與細(xì)胞相互擠壓形成不規(guī)則的形狀。性腺外觀呈褐綠性別肉眼可辨（圖 3.2d）。

(c) 生長(zhǎng)期 (d) 成熟期圖 2.2 雌性雜色鮑性腺發(fā)育分期Fig 2.2 Photomicrographs of H.diversicolor developmental stages of the ovary2.3 討論組織學(xué)切片技術(shù)是生物科研中常用到的方法。組織經(jīng)過 Bouin 氏固定液的固定，各濃度梯度的酒精脫水，二甲苯的透明以及石蠟包埋后用切片機(jī)將組織切成不同厚度的片，在經(jīng)過伊紅和蘇木精的染色就能觀察不同細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和體積。本論文通過一段間的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)切片技術(shù)上的小細(xì)節(jié)比如選擇合適的切片位置，選擇合適的切厚度、包埋時(shí)烘箱的溫度設(shè)定、二甲苯透明時(shí)的時(shí)間選擇等應(yīng)該根據(jù)不同的物種甚至同物種的不同組織來做調(diào)整。對(duì)于軟體動(dòng)物性腺發(fā)育的分期，目前國內(nèi)還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，劉爾云[61]等人根據(jù)濾的發(fā)育和精卵的成熟度，孫虎山[62]和胡建興[63]等人依據(jù)濾泡的發(fā)育和濾泡中生殖細(xì)胞的

雜色鮑性腺總RNA
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2854712