斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)在養(yǎng)殖過程中容易受到環(huán)境應(yīng)激的影響造成經(jīng)濟(jì)損失。而熱休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)是在生物體抗應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要作用的一類進(jìn)化上高度保守的蛋白。因此本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦三種熱休克蛋白,即PmHsp60、PmHsp10和PmGRP94(glucose regulated protein 94,GRP94),進(jìn)行研究分析,希望進(jìn)一步了解斑節(jié)對(duì)蝦抗應(yīng)激內(nèi)在的一些分子機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)利用已構(gòu)建的斑節(jié)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出三個(gè)熱休克蛋白EST序列,利用cDNA末端快速擴(kuò)增法(Rapid Amplification of cDNA End,RACE)獲得三個(gè)基因cDNA全長(zhǎng),并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)確定了三個(gè)基因在斑節(jié)對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)分布規(guī)律,并研究了三個(gè)熱休克蛋白基因在不同pH、鹽度和重金屬應(yīng)激下mRNA水平的表達(dá)變化情況。利用體外重組技術(shù)對(duì)PmHsp60和PmHsp10進(jìn)行重組,利用Ni-NTA樹脂進(jìn)行親和純化,純化蛋白經(jīng)復(fù)性后進(jìn)行分子伴侶活性及PmHsp60 ATPase活性分析。具體研究結(jié)果如下:(1)PmHsp60 cDNA全長(zhǎng)為2352 bp,其中包含129 bp的5’-非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)、486 bp的3’-UTR和1737 bp開放閱讀框(open reading frames,ORF),編碼578個(gè)氨基酸,PmHsp60分子量為60.99 kDa,其理論等電點(diǎn)為2.48,多重比對(duì)顯示其有一個(gè)高度保守的Chaperonin 60(cpn60)結(jié)構(gòu)域以及環(huán)形結(jié)構(gòu)域和ATP結(jié)合位點(diǎn),組織表達(dá)結(jié)果顯示PmHsp60在肝胰腺中表達(dá)最高、在鰓中表達(dá)最低;PmHsp10 cDNA全長(zhǎng)為744 bp,5’-UTR、3’-UTR和ORF分別為102 bp、333 bp和309 bp,ORF編碼102個(gè)氨基酸,分子量為11.05 kDa,理論等電點(diǎn)為7.8,組織表達(dá)結(jié)果顯示PmHsp10在肝胰腺中表達(dá)最高、在鰓和淋巴中表達(dá)最低;PmGRP94 cDNA全長(zhǎng)2 990 bp,包括75 bp的5’-UTR、527 bp的3’-UTR和2388 bp的ORF,PmGRP94蛋白理論分子量大小和等電點(diǎn)分別為91.32 KDa和4.72,同源比對(duì)結(jié)果顯示,PmGRP94有一個(gè)Hsp90保守結(jié)構(gòu)域,N端有一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn),組織表達(dá)結(jié)果顯示其在肝胰腺中表達(dá)最高、在淋巴中表達(dá)最低。(2)環(huán)境應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中,斑節(jié)對(duì)蝦進(jìn)行pH 7.0、pH 9.0、低鹽23‰、高鹽43‰以及重金屬銅(Cu)、鋅(Zn)和鎘(Cd)應(yīng)激。PmHsp60、PmHsp10和PmGRP94在應(yīng)激后不同程度的被誘導(dǎo)表達(dá)。在ph7.0應(yīng)激后鰓中pmhsp60表達(dá)水平上調(diào)并且在96h達(dá)到高峰值,pmhsp10在6h時(shí)表達(dá)上調(diào),在6h,48h和96h時(shí)mrna表達(dá)水平達(dá)到最大。在肝胰腺中,pmhsp60mrna的表達(dá)水平12h和48h上調(diào),而pmhsp10沒有明顯的變化;在ph9.0應(yīng)激下,鰓中pmhsp60和pmhsp10轉(zhuǎn)錄水平在應(yīng)激6h后快速上調(diào),12h又下調(diào),在48h處達(dá)到最大值。在肝胰腺中,pmhsp60和pmhsp10轉(zhuǎn)錄水平在12h處上調(diào),之后下調(diào)至正常水平,到96h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大值;低鹽處理后,鰓中pmhsp10在4h達(dá)到最大表達(dá)量,之后逐漸下調(diào),在肝胰腺中pmhsp10在4h上調(diào),并在4h、8h和32h達(dá)到最大表達(dá),而在低鹽下,pmhsp60在兩個(gè)組織中的表達(dá)量輕微的上調(diào);高鹽度下,鰓中pmhsp60轉(zhuǎn)錄水平32h達(dá)到最大水平,而pmhsp10表達(dá)量在16h處達(dá)到最大值,在肝胰腺中pmhsp60和pmhsp10均在4h處上調(diào)且維持到16h,之后下調(diào);cu應(yīng)激下,pmhsp60鰓中轉(zhuǎn)錄水平在12h處顯著上調(diào),在24h和48h處下調(diào),在96h處達(dá)到最大值,pmhsp10在鰓中48h前被輕微的誘導(dǎo),96h達(dá)到最大值,在肝胰腺中二者表達(dá)水平和對(duì)照比沒有明顯變化;在zn應(yīng)激下,pmhsp60和pmhsp10有相似的變化趨勢(shì)。在鰓中,pmhsp60和pmhsp10在12h達(dá)到最大表達(dá)量,在肝胰腺中,二者表達(dá)量在應(yīng)激初期就上調(diào),在24h處達(dá)到最大值;在cd處理組,鰓中pmhsp60表達(dá)量在24h處顯著上調(diào)并達(dá)到最大值,而pmhsp10在12h處達(dá)到最大值。在肝胰腺中pmhsp60和pmhsp10最大表達(dá)量在6h和48h發(fā)現(xiàn);ph7處理以后,pmgrp94表達(dá)量與對(duì)照相比12h前變化不明顯,在第24h處達(dá)到最大表達(dá)量,48h和96h表達(dá)水平又降低;在ph9處理組,pmgrp94的相對(duì)表達(dá)量在應(yīng)激后6h即被誘導(dǎo),應(yīng)激后48h其表達(dá)量達(dá)到最大,應(yīng)激96h后表達(dá)水平又下降,但仍高于正常水平;低鹽度組,表達(dá)均未出現(xiàn)上調(diào),16h和32h均低于對(duì)照;在高鹽度應(yīng)激下,pmgrp94表達(dá)量從8h后上調(diào),在16h達(dá)到最大表達(dá)量,應(yīng)激后32h表達(dá)量下調(diào),但依然高于對(duì)照;在cu刺激下,pmgrp94相對(duì)表達(dá)量在6h達(dá)到最大值,之后表達(dá)下調(diào)并保持相對(duì)較低的水平,但還是高于0h對(duì)照的表達(dá)水平;cd刺激下,pmgrp94mrna轉(zhuǎn)錄水平在從6h到96h有輕微的上調(diào),在96h處達(dá)最大值;在zn刺激下,pmgrp94表達(dá)量應(yīng)激后12h開始上調(diào),在24h處顯著上調(diào),達(dá)到最大表達(dá)量,之后下調(diào)至正常水平。(3)pmhsp60atpase活性測(cè)定從0到60°c,在37-42°c時(shí)有最高活性。當(dāng)pmhsp10加入反應(yīng)體系后。從0到60°c范圍內(nèi)其總活性有所升高,增量最少的溫度為60°c。熱誘導(dǎo)cs聚集被用來測(cè)定pmhsp60分子伴侶活性。在hsp60/cs為1:1時(shí)有21%的蛋白被保護(hù)。隨著pmhsp60的增加,蛋白保護(hù)程度得到提高。Hsp60/CS為2:1時(shí)約有57%的蛋白被保護(hù),4:1時(shí)超過60%蛋白被保護(hù)。Hsp60/CS為4:1只有約38%的被保護(hù)。而當(dāng)PmHsp60/PmHsp10/CS混合比例為Hsp60/Hsp10/CS=4:4:1時(shí),約76%蛋白被保護(hù)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

oES(Hsp60-Hsp10)復(fù)合體結(jié)構(gòu)。（a）大腸桿菌 GroEL 亞結(jié)構(gòu)域、赤道結(jié)構(gòu)域?yàn)榛疑�，紅色的螺旋 H 和 I 為結(jié)合）GroEL 端視圖；（d-f）對(duì)應(yīng)視圖下的 GREL 和 GRESStructures of GroEL and the GroEL–GroES Complex. (a) Serichia coli.Apical, intermediate, and equatorial domains aespectively. Helices H and I involved in the binding of subsre shown in red. (b) Side view of the GroEL. (c) End view alent views of GroEL in complex with the cofactor GroES ase 和蛋白折疊過程。（a）GroEL 結(jié)合未折疊的多肽；（

S(Hsp60-Hsp10)復(fù)合體結(jié)構(gòu)。（a）大腸桿菌 GroEL構(gòu)域、赤道結(jié)構(gòu)域?yàn)榛疑�，紅色的螺旋 H 和 I 為結(jié)GroEL 端視圖；（d-f）對(duì)應(yīng)視圖下的 GREL 和 GRructures of GroEL and the GroEL–GroES Complex. (aichia coli.Apical, intermediate, and equatorial domainpectively. Helices H and I involved in the binding of su shown in red. (b) Side view of the GroEL. (c) End vieent views of GroEL in complex with the cofactor GroE

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文PmHsp60 ATPase 活性方面進(jìn)行了分析。為更好的理解斑節(jié)對(duì)蝦在生理水平上對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制及熱休克蛋白在此調(diào)控機(jī)制中所起的作用提供前期理論基礎(chǔ)。1.4.2 技術(shù)路線本論文實(shí)驗(yàn)路線如下圖所示：
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本文編號(hào)：2855344