發(fā)布時間：2020-10-22 04:38

　　 草魚(Ctenopharyngon idellus)是亞洲國家廣泛養(yǎng)殖的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚類,是我國傳統(tǒng)的“四大家魚”之一。但草魚出血病的時常爆發(fā)給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。草魚呼腸孤病毒是導(dǎo)致草魚出血病的主要病毒性病原。在我國分離出來的數(shù)十株草魚來源呼腸孤病毒中,可分為草魚Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型呼腸孤病毒,它們的代表株分別為GCRV-873、GCRV-HZ08和GCRV-104。蛋白酶體是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊、異常累積、衰老損傷等蛋白質(zhì)的主要細(xì)胞器之一,是非溶酶體-泛素依賴型蛋白降解過程中的核心蛋白酶,參與了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)控,抗原處理,信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞周期調(diào)控,細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等多種過程。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了草魚PSMB7蛋白與草魚Ⅲ型呼腸孤病毒外衣殼蛋白VP38之間存在潛在的相互作用,并利用多種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)驗證了草魚三種基因型呼腸孤病毒外衣殼蛋白VP7,VP35,VP38與PSMB7之間的相互作用。具體研究內(nèi)容如下:1.利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與草魚Ⅲ型呼腸孤病毒VP6和VP38相互作用的宿主蛋白利用酵母雙雜交篩選了能與GCRV104 VP6和VP38相互作用的宿主蛋白。利用RT-PCR擴(kuò)增GCRV104 s8和s10基因組片段,構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38;對重組質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞毒性和自激活檢測,分別以VP6和VP38為誘餌在草魚酵母文庫中篩選與其相互作用的宿主蛋白,對篩選得到的陽性酵母菌落進(jìn)行測序分析。結(jié)果表明,兩個誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38均無自激活作用;誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6篩選到7株陽性克隆,分別編碼β肌動蛋白、augmin樣復(fù)合體亞基2、甘露糖苷酶α2b1亞基、程序性細(xì)胞死亡蛋白6、真核翻譯延長因子1γ和一個未知功能蛋白;誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP38篩選到4株陽性克隆,分別編碼剪切與多聚腺苷酸化特異性因子5、高遷移率組蛋白核小體結(jié)合結(jié)構(gòu)域2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體X和蛋白酶體亞基β7。2.GCRV-104 VP38與PSMB7的表達(dá)分析以及多克隆抗體制備為進(jìn)一步研究VP38的生物學(xué)功能,及為后續(xù)實驗準(zhǔn)備良好的實驗材料,實驗構(gòu)建了VP38蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VP38,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)之后純化蛋白,免疫小鼠,制備多克隆抗;利用Western blot及IFA對所得鼠抗VP38多克隆抗體進(jìn)行評估,同時利用該多克隆抗體對GCRV-104感染CIK細(xì)胞后不同時間點VP38的表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示本實驗制備的多克隆抗體能夠特異性地識別原核表達(dá)的重組蛋白及GCRV-104感染細(xì)胞樣品中的VP38蛋白;VP38蛋白在感染72 h后主要分布在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,呈均質(zhì)分布;VP38在GCRV104感染前期微量表達(dá),中后期大量表達(dá)。為進(jìn)一步驗證PSMB7與VP38的相互作用,探究PSMB7在病毒感染過程中的表達(dá)特性以及具體功能,我們根據(jù)草魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息,利用RT-PCR擴(kuò)增了PSMB7的全長ORF,同時對PSMB7的基因序列及氨基酸序列進(jìn)行了分析,構(gòu)建了PSMB7的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-PSMB7及真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-PSMB7;pET28a-PSMB7轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞后,利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),將純化后的蛋白免疫小鼠,獲得鼠源多克隆抗體;利用Western blot對制備的多克隆抗體進(jìn)行分析;pEGFP-N1-PSMB7轉(zhuǎn)染至GCO細(xì)胞后進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;結(jié)果表明,草魚psmb7基因全長834bp,編碼277個氨基酸,具有保守性酶活位點,為Ntn-水解酶超家族成員;PSMB7在GCO細(xì)胞中主要分布在核周區(qū)域;實驗制備的PSMB7多克隆抗體能夠特異性識別草魚CIK細(xì)胞及GCO細(xì)胞的內(nèi)源PSMB7蛋白,該多抗具有較高的效價和較好的特異性。3.草魚三種基因型呼腸孤病毒外衣殼蛋白與蛋白酶體亞基β7(PSMB7)的相互作用本章節(jié)利用定向酵母雙雜交技術(shù)、Far western blot、His Pull-Down、細(xì)胞內(nèi)共定位、Co-IP等技術(shù)驗證了VP38與PSMB7之間的相互作用;并利用酵母雙雜交、Co-IP驗證了PSMB7同時也能夠與草魚Ⅰ型和Ⅱ型呼腸孤病毒的外衣殼蛋白VP7和VP35相互作用;對PSMB7進(jìn)行截斷,利用酵母雙雜交實驗探究了不同截斷與VP38的相互作用;利用制備的多克隆抗體及realtime RT-PCR對病毒感染后PSMB7在翻譯及轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量變化進(jìn)行了監(jiān)測。結(jié)果顯示PSMB7與草魚三種基因型呼腸孤病毒的外衣殼蛋白均發(fā)生相互作用;VP38與PSMB7之間為多位點相互作用;GCRV-JX01及GCRV104感染后PSMB7在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),而在翻譯水平無明顯變化。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選了與GCRV-104編碼的VP6和VP38蛋白存在潛在相互作用的宿主蛋白,對VP38和PSMB7進(jìn)行了表達(dá)、分析及多克隆抗體的制備,利用多種實驗技術(shù)驗證了PSMB7與草魚三種呼腸孤病毒外衣殼蛋白的相互作用,探究了PSMB7在病毒感染后在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)量變化,為進(jìn)一步了解GCRV的感染機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

圖 2-1 s8 和 s10 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果M：DL2000 標(biāo)尺；NC：陰性對照 Amplification result of GCRV-104 s8 and s10 bM:DL2000 Marker；NC:Negative Control激活檢測DT7 質(zhì)粒的酵母 AH109 在 SD/-Trp 平GBKT7-VP6/pGADT7 與 pGBKT7-VPu 平板上均生長良好（圖 2-2）；分別 與 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH。該結(jié)果表明：VP6 蛋白和 VP38 蛋白對

圖 2-2 pGBKT7-VP6 與 pGBKT7-VP38 的自激活檢測化質(zhì)粒 pGBKT7-VP6/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板的粒 pGBKT7-VP6/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu-His 平板質(zhì)粒 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板質(zhì)粒 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu-His 平Fig.2-2 Self-activation detection of pGBKT7-VP6 and pGBKT7-VP38109 transformants with pGBKT7-VP6/pGADT7 grown on SD/-Trp-Leu09 transformants with pGBKT7-VP6/pGADT7 did not grow on SD/-Trplates;09 transformants with pGBKT7-VP38/pGADT7 grown on SD/-Trp-Le09 transformants with pGBKT7-VP38/pGADT7 did not grow on SD/-Tplates

圖 2-3 SD/-Trp-Leu 平板篩選的陽性菌落A：攜帶有文庫質(zhì)粒與 pGBKT7-VP6 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板上生長(代表平板)；B：攜帶有文庫質(zhì)粒與 pGBKT7-VP38 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板上生長(代表平板Fig.2-3 Positive clones screened by SD/-Trp-Leu selection platesA ：AH109 transformants with pGBKT7-VP6/ library plasmid grown on SD/-Trp-Leu plates(representative plate)；B：AH109 transformants with pGBKT7-VP38/ library plasmid grown on SD/-Trp-Leu plates(representative plate)AB
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 戈賢平;繆凌鴻;;我國大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與體系研究進(jìn)展[J];中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn);2011年03期

2 陳燕燊,江育林;草魚出血病病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)及其理化特性的研究[J];科學(xué)通報;1983年18期

本文編號：2851105