發(fā)布時間：2020-10-22 02:46

　　 傳染性造血器官壞死(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)是由彈狀病毒科,粒外彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)感染引起的,可以感染所有的鮭科魚類,是一種急性的具有高度傳染性的病毒性疾病,高致病力毒株對鮭鱒幼魚的致死率達90%以上,該病現(xiàn)已成為世界性鮭鱒魚病,給鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。但目前尚無治療IHN的有效藥物,疫苗仍是預防IHNV的最有效手段之一。IHNV的主要抗原蛋白是表面糖蛋白G,含有可誘導細胞產(chǎn)生免疫中和抗體的中和抗原表位。本實驗利用生物信息學原理對其G蛋白基因序列進行信號肽區(qū)、疏水性跨膜區(qū)和抗原表位區(qū)的生物信息學分析IHNV HLJ-09株,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對G蛋白基因片段進行截短重組表達,分析表達蛋白的免疫原性和誘導虹鱒幼魚免疫保護的效果。試驗結果顯示:1.構建了pET-28a-dG原核表達載體,經(jīng)IPTG誘導后,獲得53 kDa的目的蛋白。目的蛋白純化后經(jīng)Western blotting檢測,目的蛋白可與鼠抗IHNV全病毒血清特異性識別,具有良好的免疫原性。2.利用純化的目的蛋白(dG)制備鼠抗血清,經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測該鼠抗血清均能與重組蛋白和IHNV HLJ-09株反應,其效價分別是1:25600和1:1600。利用制備的鼠抗血清進行了病毒中和試驗測定,根據(jù)Reed-Muench氏法,得出其中和效價為1:112,說明該鼠抗血清能識別IHNV并能產(chǎn)生相應的中和抗體,具有一定的中和效應。3.為分析IHNV dG誘導虹鱒幼魚的免疫保護效果,將純化后的目的蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后接種虹鱒幼魚,試驗分為3組,即滅活疫苗組、重組蛋白組和PBS對照組,每尾2μg/g魚體重的劑量進行腹腔注射。免疫后的第0、1、2、3、4、5、6周采集魚血清,檢測其特異性抗體IgM水平。結果顯示,免疫后實驗組魚抗體水平顯著提高(P0.01),并且顯著高于對照組(P0.01),在免疫后的第四周達到高峰,隨后下降。在免疫后的第四周進行攻毒保護試驗結果顯示,滅活疫苗組和重組蛋白組的相對保護率分別為62%和60%。以上結果表明,本研究利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達的截短IHNV G蛋白,能夠作為IHNV亞單位疫苗的候選免疫原,可誘導虹鱒幼魚產(chǎn)生中和抗體,抵抗IHNV的攻擊,為進一步研究IHNV的亞單位疫苗奠定了一定理論基礎。
【學位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S941.414
【部分圖文】：

類地位及生物學特征類委員會（ICTV）對彈狀病毒描述，IHNV屬于代表，與它同屬的還有病毒性出血敗血癥病毒V）、蛇頭魚彈狀病毒（Snakehead rhabdovirus,SHvirus,HIRRV），它們的共同特征是在糖蛋白和聚粒外彈狀病毒屬的一個獨特的、非結構蛋白，因科，粒外彈狀病毒屬（Novirhabdovirus）的成員[2M、N 和 L 五種結構蛋白質(zhì)和一種非結構蛋白（磷酸化蛋白，糖蛋白，膜基質(zhì)蛋白，核衣殼蛋白成病毒的外形，圓柱形核衣殼螺旋形成二十面體×60~100 nm，核心直徑 60 nm，軸孔直徑 20 nm狀突起，有囊膜和膜粒。由核衣殼、膜蛋白、囊本結構，如圖 1-1 所示。核糖核蛋白（RNP）復和聚合酶大蛋白三者與病毒的 RNA 之間的相互契和表達的模板被酶降解，保證了遺傳信息得以正確

經(jīng)常不被研究者使用。而大鱗大馬哈魚胚胎細胞系（CHSE-214）、鯉細胞系（EPC）具有繁殖快，對環(huán)境的敏感度小等特點而被廣泛的應用，并產(chǎn)生細應（cytopathic effect，CPE）。CPE特征為細胞核內(nèi)染色質(zhì)呈顆粒狀、邊緣化，核膜變大；最后細胞崩解成細胞碎片[31]。IHNV的最適生長溫度為14~16℃[20]。在IHNV-214細胞有很強的適應性，在CHSE-214細胞上能夠快速的繁殖，僅4個小時即可增殖的16 h內(nèi)呈指數(shù)生長，最后生長到達平穩(wěn)期[32]。 IHNV 的基因組結構HNV是基因組大小約為11131 bp的單股負鏈不分節(jié)段的RNA病毒，由磷酸化蛋白P、、膜基質(zhì)蛋白M、核衣殼蛋白N和RNA聚合酶大蛋白L五種結構蛋白質(zhì)和一種獨特的白（NV）組成。基因組由各蛋白基因緊密相連，其各蛋白基因的連接順序為3’端白-磷酸化蛋白-膜基質(zhì)蛋白-糖蛋白-NV-聚合酶大蛋白-5’端。其基因組的結構模式，所示，有約60個堿基組成的基因短序列在3’端形成，此基因短序列是不被翻譯的前導前導區(qū)含有上游RNA轉錄終止信號和下游基因轉錄起始信號，緊隨其后的為基因編因連接區(qū)，最后為基因的5’端，在5’端還有一個約101個堿基的短序列[33]，此段短序游基因轉錄終止信號和多聚腺苷酸化信號[33]。

東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學碩士學位論文分析HLJ-09 株 G 截短基因片段的選擇MHMM Server v.2 軟件對 IHNV HLJ-09 株 G 基因片段跨膜區(qū)的84-1836 位氨基酸之間存在一個跨膜螺旋區(qū)，跨膜區(qū)屬于疏水的形成都是在由親水性氨基酸為基礎的，疏水區(qū)則會對其有影響達，因此要避開此區(qū)域。
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本文編號：2850987