無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae),又稱為B群鏈球菌(Group B streptococcus,GBS),革蘭氏陽性菌,可導(dǎo)致多種動(dòng)物(水生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物)患病及人類多種疾病。近年來,中國羅非魚養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)暴發(fā)了嚴(yán)重的無乳鏈球菌病,沖擊了中國羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重,阻礙了中國羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展�？股刂委熈_非魚無乳鏈球菌病是目前采用的主要方法,但是抗生素的不合理使用會(huì)增加病原的耐藥性。疫苗因具有高效、安全、無殘留等特點(diǎn)是預(yù)防羅非魚無乳鏈球菌病的潛在有效手段之一,也是目前研究的熱點(diǎn)。無乳鏈球菌表面免疫原性蛋白Lrr G(Leucine-rich repeat protein from GBS)和Sip(Surface Immunogenic Protein)存在于各種血清型菌株中,高度保守,兩者在抗羅非魚無乳鏈球菌病方面均具有良好的免疫保護(hù)作用。有研究表明將兩個(gè)或兩個(gè)以上免疫原性基因融合,表達(dá)出的融合蛋白的免疫原性要優(yōu)于單一蛋白。本研究試圖將羅非魚無乳鏈球菌的兩個(gè)免疫原性基因Lrr G和Sip融合后表達(dá),獲得Lrr G-Sip融合蛋白,探討該融合蛋白能否提供更好的免疫保護(hù)率。本研究首先根據(jù)序列分析,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增羅非魚無乳鏈球菌的表面蛋白Lrr G和Sip基因,然后利用雙酶切技術(shù)將基因Lrr G和Sip串聯(lián),中間添加具有生物學(xué)保護(hù)功能的疏水性多肽接頭(Gly4Ser)3 linker序列,最后插入到原核表達(dá)載體p Cold II中,構(gòu)建原核表達(dá)載體p Cold II-Lrr G-Sip,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),經(jīng)過表達(dá)條件優(yōu)化,成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得了Lrr G-Sip融合蛋白,并將純化的融合蛋白注射免疫尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)論如下:1.羅非魚無乳鏈球菌Lrr G-Sip融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)提取無乳鏈球菌基因組DNA,查找目的基因Lrr G、Sip全基因序列,相關(guān)軟件分析目的基因序列,結(jié)合原核表達(dá)質(zhì)粒p ColdⅡ酶切位點(diǎn)和基因序列酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。為使融合蛋白的生物活性盡量接近天然蛋白,在Sip上游引物中添加具有生物學(xué)保護(hù)功能的疏水性多肽接頭(Gly4Ser)3 linker序列。鑒于Lrr G、Sip基因較大,通過重疊延伸PCR技術(shù)容易帶來堿基突變,本研究采用基因拼接技術(shù)中的雙酶切法分兩步逐個(gè)將Sip和Lrr G基因插入p Cold II載體中,構(gòu)建原核表達(dá)載體p ColdII-Lrr G-Sip。將成功構(gòu)建的融合基因原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),SDS-PAGE顯示該融合蛋白以可溶和包涵體2種形式存在。通過控制變量的方法分別研究了IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化。結(jié)果顯示在15℃、IPTG 0.5 mmol·L-1、誘導(dǎo)9h的條件下,目的蛋白呈可溶狀態(tài)的表達(dá)量最高。經(jīng)His Bind親和柱純化、Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示Lrr G-Sip融合蛋白大小與預(yù)測(cè)一致(162k Da)。說明成功構(gòu)建了融合基因,獲得了Lrr G-Sip融合蛋白,為下一步羅非魚源無乳鏈球菌Lrr G-Sip融合蛋白的免疫原性研究奠定了基礎(chǔ)。2 羅非魚無乳鏈球菌Lrr G-Sip融合蛋白免疫原性研究為探究無乳鏈球菌Lrr G和表面免疫原性蛋白Sip串聯(lián)表達(dá)的Lrr G-Sip重組融合蛋白的免疫原性,本研究將原核表達(dá)的Lrr G–Sip重組融合蛋白分別以0.5μg/g(R1組)、1.0μg/g(R2組)和1.5μg/g(R3組)每尾200μL腹腔注射免疫尼羅羅非魚,同時(shí)分別注射等同體積的1.0μg/g Sip蛋白(S組)、1.0μg/g Lrr G蛋白(L組)以及PBS(P組)作為對(duì)照,所有魚體免疫兩周后進(jìn)行無乳鏈球菌人工攻毒,攻毒劑量為其半致死濃度LD50(4.0×108cfu/m L)。結(jié)果顯示R1組對(duì)尼羅羅非魚的相對(duì)免疫保護(hù)率最高,達(dá)89.14%;且免疫后14d和28d,該組魚體血清抗體OD值分別達(dá)0.63和0.64,均顯著高于單一蛋白組(S和L)和PBS組(P0.05);R1組魚體血清過氧化物酶(POD)和堿性磷酸酶活性(AKP)在上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)也顯著高于其它組(P0.05);但溶菌酶(LZM)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性與其它組之間差異不顯著(P0.05)。初步表明Lrr G-Sip重組融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫原性明顯優(yōu)于單個(gè)蛋白,且能有效減少免疫劑量。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

-1、無乳鏈球菌表面蛋白基因 LrrG、Sip 的 PCR因的擴(kuò)增產(chǎn)物；Sip：Sip 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；Maplification of the surface protein gene LrrG and duct of LrrG gene; Sip: the amplification product o表達(dá)載體 pCold II-LrrG-Sp 基因和 pCold II 載體連接轉(zhuǎn)化后，結(jié)果顯示 Sip 正確插入到 pCold II 載 pCold II-Sip。然后，酶切后的 LrrG得陽性克隆(圖 1-2，B)，酶切檢測(cè)C)，測(cè)序結(jié)果同樣顯示成功構(gòu)建 p

圖 1-2、pCold II-LrrG -Sip 融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測(cè)Fig.1-2 Establishment and verification of the fusion gene prokaryotic expression vector pCold II-LrrG-SipM：marker DL15000；Sip：Sip 的菌落 PCR；LrrG：LrrG 的菌落 PCR；EP：BamH I 酶單切過的 pCold II 空載體；PS：BamH I 酶單切過的載體 pCold II-Sip；PS1：BamH I 和 Sal I 雙酶切 pCold II-Sip；PSL：BamH I 酶單切過的載體 pCold II-LrrG-Sip；PSL1：Sal I 和 Sac I 雙酶切 pCold II-LrrG-Sip；PSL2：Sac I 和 BamH I 雙酶切pCold II-LrrG-SipM: marker DL15000; Sip: colony PCR of Sip; LrrG: colony PCR of LrrG; EP: vector pCold II digested by BamH I;PS: vector pCold II-Sip digested by BamH I; PS1: vector pCold-Sip digested by BamH I and Sal I; PSL: vector pColdII-LrrG-Sip digested by BamH I; PSL1: vector pCold II-LrrG-Sip digested by Sal I and Sac I; PSL2: vector pColdII-LrrG-Sip digested by Sac I and BamH I.2.3 pCold II-LrrG-Sip 原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)陽性菌株在不同條件下誘導(dǎo)，目的蛋白在沉淀和上清中的表達(dá)量表現(xiàn)出差異。其中 IPTG 濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)的量影響不大(圖 1-3，A)，因此選用 0.5 mmol·L-1

圖 1-3、不同誘導(dǎo)條件下 pCold II-LrrG-Sip 的表達(dá)分析Fig.1-3The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different inducing conductionA、不同 IPTG 濃度誘導(dǎo)下 pCold II-LrrG-Sip 的表達(dá)分析。IP0：未加 IPTG 誘導(dǎo)的對(duì)照；0.1、0.5、1：IPTG的濃度分別為 0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1的全菌蛋白A, The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different IPTG concentration. IP0: the control without IPTGinducing; 0.1, 0.5, 1: total protein after inducing at IPTG concentration of 0.1 mmol·L-1, 0.5 mmol·L-1and 1.0mmol·L-1respectively.B、不同誘導(dǎo)時(shí)間下 pCold II-LrrG-Sip 的表達(dá)分析。TI6’、TI9’、TI12’：未加 IPTG 條件下誘導(dǎo) 6h、9h、12h的對(duì)照；6、9、12：誘導(dǎo)時(shí)間分別為 6h、9h、12h 的全菌蛋白B, The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different inducing time. TI6’, TI9’, TI12’: the control induced by6 h, 9 h, 12 h without IPTG; 6, 9 and 12: total protein after inducing by 6 h, 9 h, 12 h respectively.C、不同誘導(dǎo)溫度下 pCold II-LrrG-Sip 的表達(dá)分析。TE10’、TE15’、TE22’：在 10℃、15℃、22℃下未加 IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照；10、15、22：誘導(dǎo)溫度分別為 10℃、15℃、22℃的全菌蛋白C, The expression analysis of pCold II-LrrG-Sip at different inducing temperature. TE10’, TE15’, TE22’: the control
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839692