傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)隸屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)諾拉彈狀病毒屬(Novirhabdovirus),是傳染性造血器官壞死病(Infectious hematopoietic necrosis,IHN)的病原體。IHN是鮭鱒魚類的最主要病毒性疾病之一。IHN的爆發(fā)會導(dǎo)致鮭鱒魚苗高達(dá)100%的死亡率,對世界鮭鱒魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重阻礙了鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。自1953年IHN在北美引起人們關(guān)注以來,陸續(xù)在日本、歐洲和韓國也檢測到了IHNV,1988年傳入到中國。目前沒有治療IHN的有效藥物,國外商品化的IHN核酸疫苗由于存在毒株變異及生物安全因素?zé)o法直接引進(jìn)及應(yīng)用。本研究利用我國IHNV分離株,構(gòu)建了針對我國現(xiàn)行IHN的核酸疫苗,并在此基礎(chǔ)上初步開展了核酸疫苗在虹鱒接種部位的動態(tài)分布研究及疫苗載體青霉素抗性基因?qū)Νh(huán)境微生物的影響。本研究將我國IHNV分離株SD-12糖蛋白(Glycoprotein,G)基因克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建了IHN核酸疫苗(命名為pIHNsd-G)。采用背鰭基部肌肉注射的方式,以2μg/尾的劑量免疫虹鱒(Oncorhynchus mykiss)魚苗(5±0.5g)。在免疫后第4、30、60及150天,以IHNV分離株SD-12 100倍半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose,TCID50)采取腹腔注射的方式進(jìn)行攻毒試驗,計算核酸疫苗相對保護(hù)率(Relative percent survival,RPS);于免疫后第4天及第7天,利用Real-time PCR技術(shù)檢測免疫虹鱒頭腎及接種部位肌肉組織Mx-1基因表達(dá)情況;在免疫后第4天、第30天、第60天及150天檢測免疫虹鱒血清IHNV中和抗體效價;在免疫后65天內(nèi),分別于不同時間點采集循環(huán)水池里的糞便、水以及虹鱒的腸內(nèi)容物進(jìn)行氨芐青霉素抗性菌的分離鑒定;分別于免疫后不同時間點,以核酸疫苗載體的啟動子基因序列和氨芐青霉素抗性基因序列為目標(biāo)基因,利用PCR方法監(jiān)測核酸疫苗在免疫虹鱒接種部位的動態(tài)分布情況。攻毒試驗結(jié)果顯示在免疫后第4天和第30天的核酸疫苗相對保護(hù)率分別為93.4%和91.4%,在免疫后第60天和150天pIHNsd-G對虹鱒的保護(hù)率都能達(dá)到89%以上。該結(jié)果說明核酸疫苗pIHNsd-G對虹鱒具有良好的保護(hù)效果,能夠抵抗IHNV對虹鱒的進(jìn)攻。對免疫后第4天和第7天的頭腎及接種部位肌肉組織RNA中Mx-1基因的定量分析結(jié)果顯示,與空白對照組相比,Mx-1基因在兩種組織中均顯著上調(diào)表達(dá)(P0.01),這一結(jié)果為IHN核酸疫苗的早期非特異性免疫保護(hù)提供了合理的解釋。中和抗體的效價結(jié)果顯示:在免疫后第4天,所有血清中均不存在中和抗體(效價均20);在免疫后第30天,只有兩尾魚的血清中不存在中和抗體,而剩余的8尾魚血清中均存有效價不同的中和抗體,其中最高效價高達(dá)160;在免疫后第60天,所有免疫虹鱒血清中均存在中和抗體,其最高效價高達(dá)320;在免疫后第150天,有一尾魚的血清中不存在中和抗體(效價20),而剩余的9尾魚血清中均存在不同效價的中和抗體,其中一尾魚效價最高(80)。該結(jié)果說明pIHNsd-G能夠刺激虹鱒特異性免疫反應(yīng),而使免疫虹鱒產(chǎn)生中和IHNV的抗體,因而能夠阻擋IHNV的進(jìn)攻�？剐跃蛛x結(jié)果顯示:分離到的氨芐青霉素抗性菌均是天然具有氨芐青霉素抗性的氣單胞菌(Aeromonas sp)和檸檬酸桿菌(Citrobacter sp),并未分離到包括大腸桿菌在內(nèi)的任何具有抗性的指示菌,且實驗組和對照組的氨芐青霉素抗性菌的種類和數(shù)量均沒有發(fā)生統(tǒng)計學(xué)意義的改變,證明了該核酸疫苗的抗性基因?qū)琪V體內(nèi)和及體外微生物環(huán)境都是安全的。pIHNsd-G在虹鱒接種部位的PCR監(jiān)測結(jié)果顯示:在免疫后的第1天即可在注射部位的肌肉中檢測到全部pIHNsd-G目標(biāo)片段,在84天時已經(jīng)無法從注射部位肌肉中擴(kuò)增出全長氨芐青霉素抗性基因,而所有目標(biāo)基因在150天時均消失不見。本研究不但提供了具有良好保護(hù)效果的IHN核酸疫苗,還為IHN核酸疫苗的安全性評價研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S948
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 魚用核酸疫苗
        1.1.1 魚類免疫基礎(chǔ)
        1.1.2 核酸疫苗的免疫機(jī)理
        1.1.3 核酸疫苗的應(yīng)用前景及安全性
    1.2 傳染性造血器官壞死�。↖HN）
        1.2.1 IHN的臨床癥狀
        1.2.2 IHN的流行特點
        1.2.3 IHNV的生物學(xué)特征
        1.2.4 IHNV的基因組特征
        1.2.5 IHNV的基因編碼的蛋白質(zhì)特征
        1.2.6 IHNV的檢測技術(shù)
        1.2.7 IHNV的防治
    1.3 研究展望
    1.4 本試驗研究的目的和內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 試驗材料
    2.2 引物設(shè)計與合成
    2.3 IHNV病毒繁殖
    2.4 RNA的提取以及目的片段擴(kuò)增
    2.5 表達(dá)載體pIHNsd-G的構(gòu)建
    2.6 虹鱒的免疫
    2.7 樣品采集
        2.7.1 組織采集與處理
        2.7.2 血液采集與處理
    2.8 表達(dá)載體pIHNsd-G的效果驗證
        2.8.1 攻毒試驗
        2.8.2 Mx-1 基因檢測
        2.8.3 中和抗體效價測定
    2.9 核酸疫苗抗性基因環(huán)境釋放的監(jiān)測
    2.10 p IHNsd-G接種部位動態(tài)分布的監(jiān)測
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 G基因的擴(kuò)增與表達(dá)載體p IHNsd-G構(gòu)建
    3.2 pIHNsd-G保護(hù)效力分析
    3.3 Mx-1 基因檢測結(jié)果
    3.4 中和抗體效價測定結(jié)果
    3.5 抗性菌的分離結(jié)果
    3.6 pIHNsd-G的接種部位動態(tài)分布
第四章 討論
    4.1 G基因的擴(kuò)增與表達(dá)載體p IHNsd-G構(gòu)建
    4.2 pIHNsd-G保護(hù)效力分析
    4.3 抗性菌的分離結(jié)果
    4.4 pIHNsd-G的接種部位動態(tài)分布
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 申麗媛;;魚類細(xì)胞培養(yǎng)與免疫機(jī)制概述[J];農(nóng)業(yè)與技術(shù);2016年14期

2 曾憲輝;曾令兵;周勇;范玉頂;陳倩;劉文枝;張雪萍;張琳琳;;大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白MCP基因DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效果[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2015年05期

3 余澤輝;耿毅;汪開毓;周燕;范玉蕾;鄧夢玲;陳德芳;歐陽萍;黃小麗;;四川地區(qū)一株傳染性造血器官壞死病毒的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J];水產(chǎn)學(xué)報;2015年05期

4 尹偉力;林超;劉寧;賈鵬;岳志芹;孫濤;劉葒;;傳染性造血器官壞死病毒液相芯片檢測技術(shù)[J];中國動物檢疫;2015年04期

5 劉淼;徐黎明;盧彤巖;趙景壯;曹永生;劉紅柏;尹家勝;張金鳳;馮劍;;魚類傳染性造血器官壞死病毒RT-LAMP檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2014年05期

6 謝三磊;王雯慧;孫惠玲;;IHNV核衣殼蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及鑒定[J];華北農(nóng)學(xué)報;2014年03期

7 何俊強(qiáng);史秀杰;盧體康;賈鵬;鄭曉聰;于力;蘭文升;王津津;劉葒;;傳染性造血器官壞死病毒的新型環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)熒光檢測技術(shù)[J];中國動物檢疫;2014年06期

8 孫紅巖;劉文青;趙寶華;;魚類造血器官壞死病病毒檢測及其防控研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年05期

9 徐黎明;劉紅柏;尹家勝;盧彤巖;;傳染性造血器官壞死病毒-Sn1203株的基因型及糖蛋白的生物信息學(xué)分析[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2014年01期

10 徐黎明;劉洪柏;盧彤巖;;傳染性造血器官壞死病毒-Sn株基質(zhì)蛋白基因克隆及生物信息學(xué)分析[J];水產(chǎn)學(xué)報;2013年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 陶建軍;鱖魚彈狀病毒的分離、鑒定及基因組測序分析[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2006年

2 章亞男;乙型肝炎核酸疫苗的安全性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 陶健;傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白的原核表達(dá)及其免疫學(xué)鑒定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 朱旭;傳染性造血器官壞死病病毒的分離鑒定及其糖蛋白抗血清的制備和應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 鄧凱龍;Mx1基因在不同倍性鯽鯉的克隆及拷貝數(shù)研究[D];湖南師范大學(xué);2011年

本文編號：2839663