哈維弧菌(Vibrio harveyi)作為海水養(yǎng)殖業(yè)重要的致病菌,可感染多種魚、蝦、蟹等并造成大量的死亡,在水產(chǎn)養(yǎng)殖工作中受到高度重視。VI型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system,T6SS)是革蘭氏陰性菌中近幾年新發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng),目前已有很多研究證明其是與細(xì)菌毒力相關(guān)的一個跨膜蛋白分泌系統(tǒng),由多種蛋白復(fù)合體構(gòu)成,在病原菌接觸到宿主細(xì)胞后啟動,并將效應(yīng)蛋白輸送到宿主細(xì)胞內(nèi),對宿主產(chǎn)生毒害作用。在多數(shù)的霍亂弧菌(V.cholerae),銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),溶藻弧菌(V.alginolyticus),鰻弧菌(V.anguillarum),根瘤菌(Rhizobium),大腸桿菌(Escherichia Coli)等陰性菌中存在。本文研究了哈維弧菌的耐藥性及致病力,對實驗室分離到的哈維弧菌致病菌株T6SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vgr G和效應(yīng)蛋白rbs B基因進(jìn)行了克隆分析,構(gòu)建了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vgr G基因突變株,探究哈維弧菌T6SS在其致病機(jī)制中作何作用。結(jié)果如下:1.對南海沿岸海水養(yǎng)殖魚類128株分離株進(jìn)行鑒定,將rct B-tox R基因串聯(lián),運(yùn)用鄰接法(Neighbor-Jonining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,最終確定90株為哈維弧菌。采用K-B法對90株哈維弧菌分離株進(jìn)行抗生素耐藥性分析,通過系統(tǒng)聚類法以平方Euclidean距離來分析菌株間的耐藥性同類關(guān)系,結(jié)果顯示:90株哈維弧菌共有耐藥譜26種,譜型豐富度為28.9%。其中,多重耐藥譜(耐3類及以上抗生素)21種,包含菌株共35株,占總菌數(shù)38.9%。從時間分布上看,2012、2013和2014年分別具有10、18和8種耐藥譜型,從地區(qū)分布上看,海南、廣東和廣西三個地區(qū)包含17、13和2種耐藥譜型,時間與地區(qū)的耐藥譜型差異明顯。90株哈維弧菌樣本聚類分析得到group I、group II和其他組群,分別含有11、12和4種耐藥譜,耐藥譜型率分別為16.9%、57.1%和100%,而group I和group II組群進(jìn)而分為5個亞群i~v。結(jié)果表明,在廣東、海南和廣西地區(qū)養(yǎng)殖魚類中所分離到的哈維弧菌耐藥譜具有復(fù)雜多變的特征,隨著時間年份的遞增,哈維弧菌耐藥譜種類也發(fā)生著更新變化,耐藥譜不斷擴(kuò)大延伸。2.自2007-2014年的173株哈維弧菌對斑馬魚的攻毒實驗顯示,斑馬魚致死率100%的菌株數(shù)為45株,占總菌株數(shù)的26%;而致死率0%的菌株數(shù)18株,占總菌數(shù)的10.4%。斑馬魚腹腔注射攻毒后48h是斑馬魚快速死亡的時間段,說明哈維弧菌是一種快速致死宿主的病原菌。自海南陵水和廣東深圳養(yǎng)殖場患病珍珠龍膽(pearl gentian)分離得到兩株病原菌(X12XC30和X13SZ03),對菌株常規(guī)生理生化檢測,以及16S r DNA,rct B和tox R等管家基因的檢測結(jié)果綜合鑒定,生理生化指標(biāo)與哈維弧菌極為相似,根據(jù)管家基因的序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹,自然地與哈維弧菌分支聚類,可以確定這兩株菌為哈維弧菌。兩株菌對珍珠龍膽的回歸感染實驗顯示,其半數(shù)致死量LD50分別是6.58×106 CFU.g-1和9.83×105 CFU.g-1,證明哈維弧菌對珍珠龍膽具有很強(qiáng)的致病性。3.對哈維弧菌T6SS的vgr G和rbs B基因PCR擴(kuò)增,分別得到930bp和801bp的開放閱讀框,編碼310aa和267aa,用信號肽分析軟件Signal P 3.0對其序列分析發(fā)現(xiàn),vgr G基因是編碼T6SS的一個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,發(fā)現(xiàn)該蛋白在1-39 aa的位置有信號肽區(qū)域,且序列具有“COG3501”結(jié)構(gòu)域;rbs B基因是編碼T6SS的一個效應(yīng)蛋白,并且發(fā)現(xiàn)該蛋白在在1-43 aa的位置有信號肽區(qū)域,且具有“COG1879”結(jié)構(gòu)域。4.利用http://nebuilder.neb.com/系統(tǒng)設(shè)計帶有粘性末端的缺失vgr G基因的上下游片段引物,引物與p WS7848質(zhì)粒引物有相同的粘性末端,PCR擴(kuò)增得到V-UP、V-DOWN和p SW7848片段。然后采用等溫重組的方法構(gòu)建p SW7848-?vgr G重組質(zhì)粒,經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)換細(xì)菌感受態(tài)培養(yǎng);再與哈維弧菌170EGH進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。利用TCBS+5ug/m L Cm+0.2%Glucose篩選具有p SW7848-?vgr G重組質(zhì)粒的哈維弧菌,最后利用LBS+0.2%arabinose培養(yǎng)基阿拉伯糖促使啟動子p BAD控制ccd B表達(dá)毒性殺死質(zhì)粒,PCR檢測獲得最后的缺失vgr G基因的哈維弧菌株。野生株致死率為70%,基因缺失株致死率為30%,缺失株致死率明顯低于哈維弧菌野生株。說明vgr G基因所屬的T6SS在哈維弧菌致病過程中起重要作用。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S941.4
【部分圖文】：

圖 2-1 霍亂弧菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)的模式圖Fig 2-1 Type VI secretion system (T6SS) model diagram of Vibrio cholerae1.2.2.3 T6SS 的結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)現(xiàn) T6SS 后，至今對 IcmF 結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了較多深入的研究，包括其結(jié)構(gòu)以及蛋白活性等，其還參與分泌 Hcp 導(dǎo)管的形成，敲除 icmF 的突變株，則上清中檢測不到 Hcp 蛋白。2011 年，對禽病原性大腸桿菌（APEC）研究發(fā)現(xiàn)，T6SS 中的icmF 可能扮演致病因子的角色，也可能在病菌流行病傳播過程，通過生物膜的形成并增強(qiáng)毒性[97]。AAA+ATP 酶的 ClpB 構(gòu)成了 T6SS 的一個能量供應(yīng)體系。2013年，克隆到愛德華菌（Edwardsiella ictaluri）H51 溶血素共調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因 hcp，表達(dá)成功后并制備高效的多克隆抗體。vgrG 蛋白的結(jié)構(gòu)與 T4 噬菌體尾穗蛋白質(zhì)片段相似，形成一個復(fù)雜的 T6SS 注射器結(jié)構(gòu)尾管，尾部尖端用于穿刺細(xì)菌細(xì)胞膜，之后脫落，T6SS 將蛋白分泌到宿主內(nèi)[98]。1.2.2.4 T6SS 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白 G（VgrG）和溶血素共調(diào)節(jié)蛋白（Hcp）是 T6SS 中

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文（Hapalogenys nitens）、芝麻斑（Epinephelus sp）等；海南沿岸（包括海線陵水新村港、文昌煙堆、文昌鋪前、三亞紅沙、瓊海譚門、黎安）主要宿主是烏鯧（Formio niger）、棕點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus躉、卵形鯧鲹、點(diǎn)籃子魚、布氏鯧鲹（Trachinotus blochii）、東星斑ctropomus leopardus）、青石斑魚、軍曹魚（Rachycentron canadum）和川Lutjanus sebae）等；一些菌株分離自廣西北海地區(qū)棕點(diǎn)石斑魚。

注：圖 A-rctB 544bp，圖 B- toxR 382bp。圖 2-2 基因片段電泳檢測結(jié)果Fig. 2-2 Results of amplified fragments by electrophoresising.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建將測序所得基因序列在 NCBI 中進(jìn)行同源性分析，與參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)（圖 2-3 至圖 2-5）。90 株能擴(kuò)增得到 toxR 基因的菌株建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹 90 株病原菌都能夠自然地聚類到哈維弧菌參考菌株分支上，且沒有其他入其中；rctB 基因擴(kuò)增的 110 株病原菌 109 株能自然的聚類到哈維弧菌參支上，僅 XC20 菌株離哈維弧菌分支較遠(yuǎn)；rctB-toxR 基因串聯(lián)后，構(gòu)建系樹，可以得到 90 株病原菌自然聚類到哈維弧菌分支上，確定這 90 株為哈。
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本文編號：2838573