嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是導(dǎo)致淡水魚類細菌性敗血癥的主要病原,廣泛存在于世界各地,流行地域廣、感染種類多,對不同生長階段的魚類均致病。因發(fā)病周期長、致死率高,往往給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。多年來,抗菌素一直是漁業(yè)生產(chǎn)中防治病害發(fā)生的主要手段,也對水產(chǎn)品安全和環(huán)境安全帶來威脅。目前,替代抗菌素的水產(chǎn)益生菌應(yīng)用已成為水產(chǎn)動物病害防控的研究熱點和期望,水產(chǎn)動物腸道微生物菌群是開發(fā)益生菌重要的來源之一,具有很好的研究前景。本研究采集養(yǎng)殖水域中患不同程度細菌性敗血癥的草魚(Ctenopharyngodon idellus),在病原菌分離、鑒定的基礎(chǔ)上,研究發(fā)病不同程度草魚組織中致病菌感染量、腸道菌群結(jié)構(gòu)變化,探討致病菌與腸道菌群種類、數(shù)量之間的關(guān)系;進一步通過人工長期感染該致病菌,弄清草魚腸道優(yōu)勢菌群變化規(guī)律與致病菌數(shù)量的關(guān)系,試圖發(fā)現(xiàn)草魚腸道菌群中拮抗致病菌的有益菌,為開發(fā)草魚專用抗病有益菌提供基礎(chǔ)。獲得研究結(jié)果主要為:1.患病草魚致病菌的分離、鑒定:從漢中市水產(chǎn)實驗站采集患病草魚,通過無菌操作從病灶初步分離得到3株不同形態(tài)的細菌,其中ZB-1編號菌株數(shù)量最多,對草魚的回感攻毒試驗中ZB-1菌株致死率為90%,其余2株很低,確定ZB-1菌株為目標(biāo)菌株,經(jīng)生理生化試驗和16S rRNA基因序列比對,鑒定病原菌為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。2.患病草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)研究:實時定量PCR檢測草魚組織中致病菌的感染量,對采集的9尾病魚進行致病菌感染量分析并分為A、B、C三組。通過Illumina MiSeq測序系統(tǒng)檢測草魚腸道菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)隨著A、B、C三組草魚腎致病菌感染量的逐漸增加,門水平上的主要優(yōu)勢菌門厚壁菌門(Firmicutes)所占的比例下降了20%左右,變形菌門(Proteobacteria)所占的比例下降了10%左右,梭桿菌門(Fusobacteria)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,平均升高了近20%。屬水平上的主要優(yōu)勢菌屬芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)所占的比例都平均下降10%左右,鯨桿菌屬(Cetobacterium)所占比例呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,平均升高了近20%。3.人工感染嗜水氣單胞菌草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)變化研究:3個不同濃度致病菌長時間浸泡感染草魚,在3 d、6 d、9 d、12 d、15 d取得樣品。通過MiSeq測序系統(tǒng)檢測草魚腸道菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)在門水平上,感染3d時,處理組厚壁菌門所占比例與對照相比均下降了約15%,而后均隨時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢;變形菌門所占比例從整體來講,處理組均比對照要低;梭桿菌門所占比例在感染3d時與對照相比,有5%~30%的上升,之后達到最高后再降低。屬水平上,感染3d時,處理組芽孢桿菌屬所占比例與對照相比均有15%~20%降低,而后均隨時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢;與對照相比,假單胞菌屬和乳球菌屬所占比例隨時間的延長均呈上升趨勢,相反氣單胞菌屬(Aeromonas)所占比例有15%~20%的大幅下降;處理組鯨桿菌屬所占比例在感染3d時與對照相比,有10%~30%的上升,之后達到最高后再降低。以上結(jié)果表明,當(dāng)受到嗜水氣單胞菌感染時,草魚腸道菌群中的主要優(yōu)勢菌門厚壁菌門和變形菌門所占比例均會隨致病菌感染量的升高而降低,梭桿菌門所占比例會上升;主要優(yōu)勢菌屬芽孢桿菌屬所占比例會隨致病菌感染量的升高而降低,鯨桿菌屬所占比例會升高,氣單胞菌屬所占比例會下降。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S943
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 嗜水氣單胞菌的危害及疾病控制方法
        1.1.1 嗜水氣單胞菌的危害
        1.1.2 疾病的控制方法
    1.2 魚類腸道菌群的形成與作用
        1.2.1 魚類腸道菌群的形成與分布
        1.2.2 腸道菌群的營養(yǎng)作用
        1.2.3 腸道菌群的屏障作用
    1.3 水產(chǎn)病原菌拮抗菌的研究
    1.4 本研究的目的意義
第二章 患病草魚致病菌的分離、鑒定
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 試驗試劑
        2.1.3 試驗儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 致病菌株的分離純化
        2.2.2 分離菌株的回感試驗
        2.2.3 致病菌的生理生化試驗
        2.2.4 致病菌的分子生物學(xué)鑒定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 致病菌的分離
        2.3.2 分離菌株致病性的確定
        2.3.3 致病菌的生理生化特性
        2.3.4 16S rRNA基因測序結(jié)果
        2.3.5 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 患病草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)研究
    3.1 試驗材料
        3.1.1 試驗動物
        3.1.2 試驗試劑
        3.1.3 試驗儀器
    3.2 試驗方法
        3.2.1 樣品采集
        3.2.2 組織中致病菌感染量檢測
        3.2.3 腸道菌群DNA提取與 16S rRNA基因擴增
        3.2.4 Illumina MiSeq高通量測序
        3.2.5 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 組織中致病菌感染量
        3.3.2 MiSeq測序質(zhì)量評估
        3.3.3 腸道菌群豐富度和Alpha多樣性指數(shù)
        3.3.4 腸道菌群群落結(jié)構(gòu)多樣性
        3.3.5 腸道菌群Beta多樣性分析
        3.3.6 腸道菌群群落物種豐度圖
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 人工感染嗜水氣單胞菌草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)變化研究
    4.1 試驗材料
        4.1.1 試驗動物
        4.1.2 試驗試劑
        4.1.3 試驗儀器
    4.2 試驗方法
        4.2.1 嗜水氣單胞菌ZB-1 培養(yǎng)與計數(shù)
        4.2.2 嗜水氣單胞菌感染草魚與樣品采集
        4.2.3 腎臟中致病菌感染量檢測
        4.2.4 腸道菌群DNA提取與 16S rRNA基因擴增
        4.2.5 Illumina MiSeq高通量測序
        4.2.6 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 草魚腎臟中致病菌感染量
        4.3.2 MiSeq測序質(zhì)量評估
        4.3.3 樣本菌群豐富度和Alpha多樣性指數(shù)
        4.3.4 腸道菌群群落結(jié)構(gòu)多樣性
        4.3.5 腸道菌群Beta多樣性分析
        4.3.6 腸道菌群群落物種豐度圖
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介

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本文編號：2838551