C型凝集素是一類含有糖識別結(jié)構(gòu)域(Carbonhydrate recognition domain,CRD)的超家族,是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識別受體(Pattern-recognition receptor,PRR)。本研究以棘皮動物仿刺參(Apostichopus japonicus)為材料,綜合利用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)開展了對含單個CRD的C型凝集素(SJL-1)和含有多個功能結(jié)構(gòu)域的C型凝集素(AjCTL-2)的分子克隆、蛋白表達(dá)及免疫學(xué)功能研究,并結(jié)合各自的結(jié)構(gòu)特征探討其糖識別機(jī)制,闡釋了仿刺參C型凝集素在免疫防御中的作用。本論文對含DPN/WVD基序的單CRD結(jié)構(gòu)域的C型凝集素SJL-1進(jìn)行了免疫識別和結(jié)合活的性研究。發(fā)現(xiàn)SJL-1在仿刺參的管足、體壁和呼吸樹等水管系統(tǒng)中特異性分布。同時,體腔細(xì)胞中的SJL-1能夠響應(yīng)燦爛弧菌刺激,在12小時時其mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。體外重組SJL-1蛋白(rSJL-1)能結(jié)合LPS、PGN、Mannose和D-galactose,具有廣譜的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)結(jié)合活性。此外,rSJL-1能結(jié)合耶羅維亞酵母、畢赤酵母、金黃色葡萄球菌、短雙歧桿菌、鰻弧菌和燦爛弧菌,且SJL-1的所有體外結(jié)合活性均需要Ca~(2+)的參與。以上結(jié)果表明SJL-1能夠作為模式識別受體,含有單一的CRD結(jié)構(gòu)域,具有廣譜依賴Ca~(2+)的PAMPs和微生物識別活性。為了進(jìn)一步了解仿刺參C型凝集素的結(jié)構(gòu)與功能特征關(guān)系。本論文對含三個不同的功能結(jié)構(gòu)域的AjCTL-2進(jìn)行了免疫功能研究。AjCTL-2的三個功能結(jié)構(gòu)分別為low density lipoprotein receptor class A(LDLa)、C1r/C1s/Uegf/bone morphogenetic protein 1(CUB)和一個CRD。位于Ca~(2+)結(jié)合位點(diǎn)2的關(guān)鍵氨基酸基序?yàn)镋PN/WND。mRNA水平檢測到該蛋白在仿刺參的體腔細(xì)胞中高表達(dá)。在仿刺參受到燦爛弧菌刺激后,體腔細(xì)胞中AjCTL-2的mRNA表達(dá)水平在12小時時顯著上升。我們還檢測到AjCTL-2的重組蛋白(rAjCTL-2)能夠在體外不依賴Ca~(2+)結(jié)合D-galactose,但是rAjCTL-2對LPS、PGN和Mannose的結(jié)合活性卻未檢測到。除此之外,r AjCTL-2能結(jié)合短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、鰻弧菌(Vibrio auguillarum)和耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica),且rAjCTL-2的體外菌結(jié)合能力不依賴Ca~(2+)。本論文研究的兩種不同的仿刺參C型凝集素均能作為模式識別蛋白識別并結(jié)合PAMPs及微生物,在仿刺參免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。研究成果豐富了解棘皮動物免疫識別分子的結(jié)構(gòu)與功能,為闡明棘皮動物的免疫防御機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

2圖 1-1 脊椎動物 C 型凝集素分類[2]Fig 1-1 Classification of C-type lectin in vertebrates集素的結(jié)構(gòu)與功能集素的結(jié)構(gòu)為止，C 型凝集素的判斷標(biāo)準(zhǔn)是是否含有 CRD 結(jié)構(gòu)域，已有的蛋白晶體表明，CRD 由 120 個左右的氨基酸殘基構(gòu)成，是具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域由兩個位于側(cè)翼的 α-螺旋和若干位于結(jié)構(gòu)內(nèi)部反向平行的 β-折疊組成結(jié)構(gòu)由四個非常保守的半胱氨酸殘基（C1-C4）成型的二硫鍵連接，其著整個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而 C2 和 C3 則連接由反向平行的 β-折疊構(gòu)成的“長”結(jié)構(gòu)是 CRD 與 Ca2+及糖類結(jié)合的關(guān)鍵部位[11]。部分的 CRD 含有一 β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由一對半胱氨酸殘基（C0，C0’）形成的二硫鍵將其固定

圖 1-2 CRD 高級結(jié)構(gòu)圖[2]Fig 1-2 Tertiary structure of CRD過對多個 C 型凝集素的結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn) CRD 一般含有 4 個位點(diǎn)的位置不僅取決于 CRD 的氨基酸序列，同時也與Ca2+結(jié)合位點(diǎn) 1，2 和 3 通常位于 CRD 的 β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)附間的鹽橋有關(guān)[13]。在這 4 個 Ca2+結(jié)合位點(diǎn)中，Ca2+糖類的關(guān)鍵位點(diǎn)。C 型凝集素的糖識別活性和結(jié)合特異質(zhì)子受體的位置來決定的[14]。與 Ca2+結(jié)合的氨基酸通形成復(fù)合體，這些氨基酸殘基形成了兩組關(guān)鍵的氨基酸酸基序是“EPN”（谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸）或“QPD”（。蛋白晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明：關(guān)鍵氨基酸基序由“EPN”點(diǎn) 2 的結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變化，而是與糖結(jié)合平面上質(zhì)子互換，進(jìn)而使氫鍵結(jié)合的方向由 mannose-型轉(zhuǎn)換為 gala凝集素素的突變體結(jié)合特異性研究，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)：在

Ca2+與糖的氨基酸側(cè)鏈形成配位鍵；綠色虛線箭頭代表氫鍵；箭頭的方向供體到質(zhì)子受體的方向圖 1-3 CRD 的 Ca2+結(jié)合位點(diǎn) 2 與 Mannose 的結(jié)合圖[14]Fig 1-3 Ca2+binding site 2 of CRD bind to Mannose的功能 世紀(jì)末科學(xué)家就提出了模式識別的理論，即盡管病原微生物的它們都編碼一類結(jié)構(gòu)高度保守且種類有限的病原相關(guān)模associated molecular patterns, PAMPs）[18, 19]。 PAMPs 存在于病原內(nèi)部以維持微生物的生長和繁殖[19]。宿主通過編碼合成不同的）來識別不同的 PAMPs，這種識別作用被稱為模式識別[10]。 C R 家族的成員，能夠通過識別微生物表面多種 PAMPs 進(jìn)而結(jié)合Dectin-1 能夠特異性識別真菌表面的葡聚糖，是機(jī)體抗真菌感染
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本文編號：2838323