DMRT基因(double-sex and mab-3 related transcription factor)家族是含有一個高度保守的DM結(jié)構(gòu)域,能夠特異性地識別某些DNA序列的一類基因的集合,其功能涉及胚胎發(fā)育、性腺發(fā)育以及性別決定與分化等方面。本研究以池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)為實驗對象,從轉(zhuǎn)錄組內(nèi)篩選出類似DMRT基因家族的一個基因片段,設(shè)計引物采用RACE PCR技術(shù)獲得一段1491bp的序列,經(jīng)NCBI比對后發(fā)現(xiàn)與其他物種Dmrt1的相似度較高,遂命名為池蝶蚌Dmrt1(Hs-Dmrt1)。Hs-Dmrt1基因c DNA序列全長為1491bp,包括5’非編碼區(qū)48bp、3’非編碼區(qū)358bp、開放閱讀框序列長1095bp編碼364個氨基酸,1491bp不包括加尾信號AATAAA保守區(qū)序列和下游豐富的poly(A)序列。其中DM結(jié)構(gòu)域長141bp,一共編碼47個氨基酸,在這個結(jié)構(gòu)域中存在一個十分典型的“C2H2C4”鋅指結(jié)構(gòu)。NCBI上檢索比對的結(jié)果顯示與其他物種DM結(jié)構(gòu)域的同源性在65%-75%之間,與櫛孔扇貝的同源性最高為75%,與人(Homo sapiens)的同源性最低為65%,利用Mega4.0軟件中鄰近法構(gòu)建了Hs-Dmrt1氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹,進化樹中Hs-Dmrt1與榮類櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis)的Dmr1同屬一支,推測二者存在較大的親緣關(guān)系。采用實時熒光定量PCR分別分析4齡成體蚌11個不同組織以及不同年齡段不同性別的池蝶蚌性腺中Hs-Dmrt1基因的差異表達。結(jié)果顯示,在對比的11個組織,在精巢內(nèi)的表達量最高,在血淋巴中的表達量最低,此外在其余9個組織中均檢測到有不同程度的表達,其中在精巢中的表達量約是卵巢中的18倍;在1-5齡的池蝶蚌雌雄性性腺中均檢測到Hs-Dmrt1的表達,其中1齡蚌雌雄性腺中表達量沒有明顯差異,2-5齡蚌中都表現(xiàn)為在精巢中的表達量明顯高于卵巢,且在3齡蚌的精巢中表達量最高,約為1齡蚌精巢中的80倍。由此推斷Hs-Dmrt1可能與精子的形成及性別的調(diào)控有關(guān)。根據(jù)獲得的完整ORF框序列設(shè)計引物構(gòu)建p ET-32a-Hs-Dmrt1表達載體,將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌BL21(DE3)中進行原核表達。誘導(dǎo)后得到包括標簽在內(nèi)的57KD左右的融合蛋白,純化蛋白并定量后免疫家兔制備多克隆抗體,ELISA間接法檢測抗血清效價高于1:819200;并用Western blotting檢測抗體的特異性。通過獲得的結(jié)果得知制備的多克隆抗體能夠特異性識別純化的Hs-Dmrt1融合蛋白。最后采用免疫熒光技術(shù)將Hs-Dmrt1蛋白在精子及肝胰腺內(nèi)進行定位,結(jié)果顯示在該蛋白位于精子頭部接近尾端的細胞核內(nèi),而在肝胰腺組織細胞中則分布在細胞質(zhì)及濾泡膜上。實驗提取了池蝶蚌的基因組DNA,用Dra I,Pvu II,Eco R V和Stu I四種內(nèi)切酶建立了4個基因組文庫。根據(jù)已獲得的Hs-Dmrt1基因的c DNA序列,設(shè)計步移引物,以4個文庫的DNA為模板,步移獲得Hs-Dmrt1完整的基因組序列及其5’與3’側(cè)翼序列共5139bp。利用生物軟件對克隆得到的Hs-Dmrt1基因5’側(cè)翼序列進行分析,確定了Hs-Dmrt1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點TSS并在轉(zhuǎn)錄起始位點上游28bp處檢測到典型的TATAbox。綜合各生物在線軟件預(yù)測分析可得,在Hs-Dmrt1基因5’側(cè)翼序列中不僅發(fā)現(xiàn)了常見的幾種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,如轉(zhuǎn)錄激活蛋白AP-1、GATA-1、GATA-2、GATA-3、特化蛋白Sp1、p53腫瘤抑制因子等,還發(fā)現(xiàn)多個SRY和Sox5等性別相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,推測Hs-Dmrt1存在性別調(diào)控通路的下游,并受到SRY與Sox5的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

RNA 的質(zhì)量可以滿足后續(xù)試驗的要求。電泳圖如 圖 2.1 池蝶蚌性腺總 RNA 電泳圖譜Fig.2.1 The electrophoresis of gonad total RNA in H.schlegmrt1 基因 cDNA 全長克隆總 RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA 為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組引物進行驗證，并用 RACE-PCR 的技術(shù)進行 3’和 5.2 所示：

池蝶蚌性腺總RNA電泳圖譜

第二章 Hs-Dmrt1 基因 cDNA 的克隆及分子特征分析.3.3 Hs-Dmrt1 基因全長核酸序列分析使用 DNAMAN 軟件 Hs-Dmrt1 基因 cDNA 序列及其推導(dǎo)的氨基酸序 2.3 所示，cDNA 全長 1491bp，包括開放閱讀框 1095bp，編碼 364 個氨計蛋白大小 40KD，理論等電點 pI=8.61。5’和 3’非編碼區(qū)(UTR)分別為 385bp，3’端出現(xiàn) AATAA 加為信號。紅色下劃線標出的部分為 DM 結(jié)含 47 個氨基酸。

【參考文獻】

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本文編號：2824960