黃喉擬水龜(Mauremys mutica)是一種集食用、藥用、觀賞于一身的高值淡水龜類。由于經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)造成生境破壞以及人為過(guò)度捕撈等因素的影響,黃喉擬水龜野生種群數(shù)量急劇下降,已被國(guó)家列為瀕危物種。近年黃喉擬水龜?shù)氖袌?chǎng)需求量越來(lái)越大,催生了黃喉擬水龜?shù)娜斯ゐB(yǎng)殖,并且養(yǎng)殖規(guī)模越來(lái)越大,已成為龜類養(yǎng)殖的熱門(mén)種類之一。由于黃喉擬水龜性成熟時(shí)間較長(zhǎng),需要5年左右,產(chǎn)卵較少,一只母龜平均獲苗3-4個(gè),導(dǎo)致苗種供應(yīng)嚴(yán)重不足,制約了養(yǎng)殖規(guī)模的進(jìn)一步發(fā)展。因此,如何提高黃喉擬水龜?shù)姆敝沉κ丘B(yǎng)殖行業(yè)目前急需解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室近幾年致力于提高黃喉擬水龜繁殖力的研究,而高繁殖力黃喉擬水龜品系選育是其中的一個(gè)研究方向。母龜繁殖力的高低需要由其后代數(shù)量來(lái)確定,而由大群體自由交配產(chǎn)生的后代其系譜難以確定,導(dǎo)致后續(xù)工作難以開(kāi)展。因此,我們開(kāi)發(fā)了基于微衛(wèi)星的黃喉擬水龜親子鑒定技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以132只同齡的黃喉擬水龜父母本,及其在2013、2014兩年產(chǎn)的子代為實(shí)驗(yàn)材料,利用開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建多重PCR體系,進(jìn)行遺傳多樣性和母龜與子代間的親緣關(guān)系鑒定研究,根據(jù)鑒定結(jié)果確定繁殖力較高的黃喉擬水龜母龜個(gè)體,為高繁殖力親本選育奠定基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下三方面:1.黃喉擬水龜微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)與篩選根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所測(cè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)44對(duì)微衛(wèi)星引物,另外引用發(fā)表文獻(xiàn)中的6對(duì)微衛(wèi)星引物,共合成50對(duì)微衛(wèi)星引物,對(duì)黃喉擬水龜親本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共有34對(duì)引物的PCR產(chǎn)物條帶清晰,且特異性較好。用包含30個(gè)個(gè)體的黃喉擬水龜親本隨機(jī)群體檢測(cè)該34對(duì)微衛(wèi)星引物多態(tài)性,其中6對(duì)引物在該隨機(jī)群體中只有1個(gè)等位基因,其他28對(duì)引物的等位基因數(shù)均在4個(gè)及以上。該28個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到284個(gè)等位基因,單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)介于4-21之間,平均等位基因數(shù)10.1;多態(tài)信息含量(PIC)介于0.337-0.922之間,平均值為0.717,其中22個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC0.5,表現(xiàn)為高度多態(tài)性,另外6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC0.25表現(xiàn)為中度多態(tài)性;觀測(cè)雜合度(Ho)介于0.333-0.967之間,平均值為0.678;期望雜合度(He)介于0.396-0.942之間,平均值為0.754。無(wú)效等位基因頻率均介于-13.63-43.31%之間。2.微衛(wèi)星多重PCR體系的建立及其遺傳多樣性分析選用其中16對(duì)引物用于建立多重PCR,通過(guò)選擇引物組合,以及優(yōu)化引物濃度比例、退火溫度、循環(huán)數(shù)、熒光接頭濃度等反應(yīng)參數(shù),成功構(gòu)建了兩個(gè)均含8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多重PCR體系。體系1包含的位點(diǎn)為:sg8、mmu13、mmu1、mmu7、mmu2、sg10、mmu3、mmu4,其混合比例為5:8:8:10:2:6:2:11;反應(yīng)退火溫度為57.5℃,循環(huán)次數(shù)為22;熒光接頭濃度為2μmol/L。體系2包含的位點(diǎn)為sg3、sg16、sg11、sg29、sg22、sg5、sg23、sg27,其混合比例為:10:10:4:5:5:7:15:10;反應(yīng)退火溫度為62.5.5℃,循環(huán)次數(shù)為20;熒光接頭濃度為1.2μmol/L。采用多重PCR體系和遺傳分析儀ABI3130獲得了親本和子代群體在16個(gè)微衛(wèi)星座位上的基因型數(shù)據(jù)。根據(jù)基因型數(shù)據(jù)分析了132只黃喉擬水龜親龜與598只子龜?shù)倪z傳多樣性,結(jié)果表明親本與子代群體在16個(gè)微衛(wèi)星座位上均具有較高的基因變異程度,遺傳多樣性較豐富,且子代遺傳多樣性與較為豐富的一方親本更為接近。3.黃喉擬水龜親子鑒定及其在高繁殖力親本選育中的應(yīng)用依據(jù)89只母龜,以及2013年與2014年分別產(chǎn)的296只與302只子龜?shù)幕蛐蛿?shù)據(jù),先采用Cervus 3.0軟件以2013年產(chǎn)的子代與候選母本組成的待檢群體為例,進(jìn)行在雙親基因型未知時(shí)親本排除率分析:16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中單個(gè)位點(diǎn)的親本排除概率介于9.2%與74.7%之間,累積排除概率為99.99%。然后對(duì)2013、2014兩年產(chǎn)的子代與其母本群體進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定,結(jié)果顯示:在95%的置信度標(biāo)準(zhǔn)下,模擬鑒定率均接近100%,實(shí)際鑒定率分別為87%和94%。根據(jù)親子鑒定結(jié)果,母龜在2013與2014兩年產(chǎn)下的子代數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:2013年可能有母龜沒(méi)有產(chǎn)下后代,而2014年至少有一個(gè)母本未產(chǎn)下后代;母本m2、m16、m17、m23、m27、m38、m43、m73、m117、m124在2013年與2014年的子代數(shù)均不低于5個(gè),表現(xiàn)出較高的繁殖能力,這些母本及子代都是黃喉擬水龜高繁殖力品系的選育對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)中建立的微衛(wèi)星多重PCR為黃喉擬水龜親子鑒定提供了工具,而2013與2014兩年的親子鑒定實(shí)驗(yàn),則是黃喉擬水龜高繁殖力親本選育的前期工作,為后期分子輔助育種技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S966.5
【部分圖文】：

采用微量組織試劑盒法提取指甲DNA，在樣品DNA含量較低，樣品組織難以破碎的情況下，快速地提取到了質(zhì)量較高的黃喉擬水龜基因組DNA，部分DNA如圖1-1所示，目的條帶位置在Marker DL15000bp最大片段條帶上面，說(shuō)明提取的黃喉擬水龜基因組DNA大于15000bp以上，完整性較好；拖帶不是很明顯，說(shuō)明DNA降解片段較少。經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，濃度達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)的要求，且大部分DNA OD(260/280)值介于1.8-2.0之間，說(shuō)明純度較高。圖 1-1 黃喉擬水龜基因組 DNAMarker：DL15000bpFig1-1 The extracted total genomic DNA of Asian Yellow Pond TurtleMarker：DL15000bp2.2 引物設(shè)計(jì)及其篩選用50對(duì)引物在黃喉擬水龜基因組DNA中進(jìn)行PCR反應(yīng)，以檢測(cè)其擴(kuò)增效果及多態(tài)性。經(jīng)電泳檢測(cè)，共有34對(duì)引物有條帶清晰

18圖1-2 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)mmu3(a)、mmu4(b)、mmu13(c)、sg8(d)引物在30個(gè)個(gè)黃喉擬水龜隨機(jī)個(gè)體中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜。注：H 代表峰值，S 代表片段大小;在該個(gè)體中，位點(diǎn) mmu3 與 mmu4 有一條峰，表明只有一個(gè)等位基因，位點(diǎn) mmu13 與 sg8 有兩條峰，表明有兩個(gè)等位基因。Fig1-2 Electrophorograms of PCR products of primers of microsatellite mmu3(a)、mmu4(b)mmu13(c)、sg8(d) in 30 random Asian Yellow Pond Turtle.Note：H stands for peak value, S stands for fragment size; in the sample, there is onepeak ,which means one allele, in both locus mmu3 and mmu4; while two peaks, which mean twoalleles in both locus mmu13 and sg8.在電泳圖譜中，通過(guò) Peak Scanner Software V1.0 軟件自動(dòng)識(shí)別微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR 產(chǎn)物片段大小，從而區(qū)分不同的等位基因。1 個(gè)個(gè)體在一個(gè)微衛(wèi)星座位上的

用鑷子將保存在無(wú)水乙醇中的子代指甲從1.5mL離心管中取出，用滅菌水清洗去除組織中的酒精，用微組織DNA提取試劑盒大批量提取黃喉擬水龜基因組DNA(圖2-1)，方法參考第一章1.3.1。圖2-1 黃喉擬水龜子代基因組DNAmarker：DL15000 bp DNA marker

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2820975