鮭鱒魚是世界性的主養(yǎng)冷水魚類,其肌肉富含人體必需的氨基酸、不飽和脂肪酸等,是優(yōu)質(zhì)的高端水產(chǎn)品,市場(chǎng)需求巨大。工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖是實(shí)現(xiàn)鮭鱒魚高密度、高品質(zhì)、高產(chǎn)量的重要生產(chǎn)方式之一,目前,高密度循環(huán)水條件下的鮭鱒魚養(yǎng)殖出現(xiàn)了諸如魚類病害多發(fā)等問(wèn)題,制約著鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的快速可持續(xù)發(fā)展。亟需從加強(qiáng)魚體健康的角度出發(fā),探究出一條生態(tài)安全可行的鮭鱒魚疾病預(yù)防策略,在此情形下,篩選和研制高效的益生型菌株,應(yīng)用于鮭鱒魚工廠化養(yǎng)殖過(guò)程,是改善魚類健康、增強(qiáng)魚類抵抗病原菌能力的優(yōu)先策略。本研究以大西洋鮭和虹鱒為研究對(duì)象,將篩選研制的具有特殊拮抗活性的潛在益生型菌株應(yīng)用于鮭鱒魚工廠化養(yǎng)殖,探究其對(duì)鮭鱒魚的益生效果,從魚類生長(zhǎng),存活,免疫、拮抗病原菌能力,腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)等多角度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),為后續(xù)商業(yè)化推廣和應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本研究的主要成果如下:1.通過(guò)采集健康及患病大西洋鮭魚,初步構(gòu)建了感染殺鮭氣單胞菌的鮭鱒魚致病模型,聯(lián)合運(yùn)用DGGE和16S r RNA基因測(cè)序技術(shù),深入探究鮭鱒魚腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu),以期查明魚類健康狀態(tài)與腸道微生物菌群之間的關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn):健康大西洋鮭腸道中的主要微生物組成為變形菌門(Proteobacteria,44.33%),放線菌門(Actinobacteria,17.89%),擬桿菌門(Bacteroidetes,15.25%)和厚壁菌門(Firmicutes,9.11%),其中,Oxalobacteraceae科和微球菌科(Micrococcaceae)的某些屬,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas),鏈霉菌屬(Streptomyces),乳球菌屬(Lactococcus)和Pedobacter菌屬的細(xì)菌是健康大西洋鮭腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬。然而病魚腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)微生物門類則稍有差異,主要為變形菌門(Proteobacteria,70.46%),擬桿菌門(Bacteroidetes,7.59%),厚壁菌門(Firmicutes,7.55%)和綠彎菌門(Chloroflexi,2.71%),氣單胞菌科(Aeromonadaceae)和腐螺旋菌科(Saprospiraceae)的某些屬,Aliivibrio菌屬,弧菌屬(Vibrio),和梭菌屬(Clostridium)是病死魚腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬,研究證實(shí)健康大西洋鮭與病魚腸道中微生物菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異�；趯�(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格控制條件下所構(gòu)建的精準(zhǔn)大西洋鮭致病菌侵染模型研究發(fā)現(xiàn),殺鮭氣單胞菌侵染急劇降低了大西洋鮭腸道中微生物菌群種類,且隨著攻毒濃度的升高逐步下降,同時(shí)造成大西洋鮭腸道微生態(tài)平衡的嚴(yán)重破壞,顯著降低大西洋鮭腸道微生物菌群多樣性,魚類腸道微生物菌群與魚類健康狀態(tài)之間關(guān)系緊密。2.驗(yàn)證了篩選的芽孢桿菌V4菌株和膠紅酵母復(fù)合菌劑對(duì)工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖虹鱒的益生效果。分別發(fā)酵芽孢桿菌V4(B.velezensis V4)和膠紅酵母(R.mucilaginosa)制備復(fù)合菌劑,添加投喂虹鱒,探究其對(duì)于虹鱒幼魚生長(zhǎng)、存活、餌料利用等方面影響,同時(shí)綜合運(yùn)用PCR-DGGE指紋圖譜分析及基于16S r RNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)研究復(fù)合菌劑對(duì)虹鱒胃及腸道黏膜微生物、腸道內(nèi)容物中微生物菌群影響,研究發(fā)現(xiàn):T1菌劑添加組(B.velezensis V4/R.mucilaginosa,5×106/5×107 CFU/g)虹鱒的增重、特定生長(zhǎng)率均顯著提升,餌料系數(shù)顯著降低,而所有菌劑添加組虹鱒的存活率均顯著改善�；诤琪V腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的UPGMA和PCo A分析顯示,對(duì)照組與復(fù)合菌劑添加組腸道中微生物菌群結(jié)構(gòu)并未顯著差異,但復(fù)合菌劑添加組微生物菌群多樣性(Chao1指數(shù),Shannon多樣性指數(shù)等)均有所提高,益生型嗜冷桿菌屬(Psychrobacter),芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus),乳球菌屬(Lactococcus)及鏈霉菌屬(Streptomyces)在復(fù)合菌劑添加組得到有效提升,同時(shí),潛在致病菌伯克氏菌屬(Burkholderia)的豐度得到有效遏制。3.芽孢桿菌V4(B.velezensis V4)及膠紅酵母(R.mucilaginosa)應(yīng)用于大西洋鮭幼魚養(yǎng)殖,實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn):添加復(fù)合菌劑能夠顯著促進(jìn)大西洋鮭生長(zhǎng),提高存活率,提高飼料利用率,在養(yǎng)殖初始實(shí)驗(yàn)階段,復(fù)合菌劑添加組大西洋鮭血清中丙二醛(MDA),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和一氧化氮(NO)的含量顯著降低(P0.05),同時(shí),隨著復(fù)合菌添加濃度的升高,血清中MDA、GPT和NO的含量持續(xù)降低。在T1菌劑添加組中(B.velezensis V4/R.mucilaginosa,5×106 CFU g 1/5×107 CFU g 1),血清中總超氧化物歧化酶(t-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、總抗氧化力(T-AOC)和免疫球蛋白M(Ig M)的含量顯著高于對(duì)照組(P0.05)。皮質(zhì)醇(cortisol)的含量在所有復(fù)合菌添加組中均有顯著提高(P0.05)。復(fù)合菌劑添加實(shí)驗(yàn)組攻毒后的累積死亡率低于對(duì)照組,表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性。復(fù)合菌劑顯著提高了大西洋鮭幼魚在殺鮭氣單胞菌侵染后血清中總超氧化物歧化酶(tSOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活力,同樣,谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和酸性磷酸酶(ACP)的活性在復(fù)合菌添加組有顯著升高,尤其在感染后的48小時(shí)。溶菌酶活性(LZM)在T1和T3實(shí)驗(yàn)組中有部分提升,血清免疫球蛋白M(Ig M)和皮質(zhì)醇(cortisol)的水平在復(fù)合菌劑添加組有顯著提升,說(shuō)明復(fù)合菌的使用能有效調(diào)控大西洋鮭魚的免疫應(yīng)答,尤其在殺鮭氣單胞菌侵染后復(fù)合菌投喂組大西洋鮭表現(xiàn)出強(qiáng)烈的益生作用,同時(shí)對(duì)于大西洋鮭腸道微生物菌群微生態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。4.評(píng)估了單一芽孢桿菌V4菌株對(duì)鮭鱒魚類的影響。經(jīng)過(guò)70天的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)及后續(xù)的殺鮭氣單胞菌侵染實(shí)驗(yàn),共同探究和驗(yàn)證了芽孢桿菌V4菌株對(duì)虹鱒的生長(zhǎng)、存活、飼料利用、免疫能力、拮抗病原菌及腸道菌群的影響,綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌V4添加能夠提高虹鱒存活率,提高了飼料利用率,同時(shí)增強(qiáng)了虹鱒的免疫應(yīng)答、抗氧化應(yīng)激及拮抗病原菌能力,尤其在殺鮭氣單胞菌侵染后芽孢桿菌V4投喂組虹鱒表現(xiàn)出強(qiáng)烈的益生作用,同時(shí)芽孢桿菌添加組,蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)豐度有升高趨勢(shì),甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)和鼠乳桿菌(Lactobacillus murinus)的豐度也隨著芽孢桿菌V4添加濃度的增大而升高,且甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的增長(zhǎng)趨勢(shì)顯著,綜合結(jié)果顯示芽孢桿菌V4對(duì)虹鱒腸道微生物菌群微生態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響,未影響其腸道內(nèi)原有菌群的微生態(tài)平衡。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S965
【部分圖文】：

第二章 文獻(xiàn)綜述良使用相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培分離(Davis et al., 2005)。許多細(xì)菌在長(zhǎng)期的適應(yīng)和進(jìn)化過(guò)程中可能早已適應(yīng)了棲息地的環(huán)境，所以有研員就模擬細(xì)菌在自然界的生長(zhǎng)環(huán)境，以期分離未培養(yǎng)的微生物。其中比較經(jīng)典的就散盒方法（diffusionchamber）的設(shè)計(jì)。科研人員在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，設(shè)計(jì) 種簡(jiǎn)易（圖 2.1），上下兩層覆蓋能夠允許周圍環(huán)境中物質(zhì)自由進(jìn)出的聚碳酸酯膜，以模擬環(huán)境及環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，他們成功的從海水沉積物中分離得到了 些未被培養(yǎng)的細(xì)菌，隨后又將這些細(xì)菌接種到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果顯示分離到的細(xì)菌需要在其他細(xì)菌的輔助下才能生長(zhǎng)，顯示出 定的依賴性(Kaeberlein et al., 2利用相似原理研究人員還分離出很多之前不能培養(yǎng)的微生物(Bollmann et al., Nichols et al., 2008)。

第二章 文獻(xiàn)綜述008)。理論上，DGGE 圖譜中每 條譜帶代表 代表微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，同時(shí)可以通過(guò)，分析微生物組成。該技術(shù)方法最初由 Fischerd Lerman, 1979)，隨后被廣泛應(yīng)用。為了使 DG在引物末端加入 段富含 GC 的片段（GC-cl5)，提高 DGGE 的靈敏性和保真性，改進(jìn)后的上的差異。

死魚腸道微生物群落變bial communities from h健康魚樣品；D1、D2mples collected from heafish, respectively魚腸道微生物群落的群落結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)物群落與病死魚腸道CA 排序結(jié)果同樣顯示能很好的聚在 起

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2820963