由于長江生態(tài)環(huán)境的惡化,中華鱘(Acipenser sinensis)關(guān)鍵棲息地面積逐漸縮小,適合度降低,自然繁殖由連續(xù)變?yōu)榕及l(fā),自然種群資源被破壞后難以短期內(nèi)自主恢復(fù),野生資源瀕臨滅絕。全人工繁殖的成功,使保存種質(zhì)資源和恢復(fù)野外種群成為可能。然而,中華鱘第二性征不明顯,生殖狀態(tài)難以準(zhǔn)確判斷,且人工繁殖過程中出現(xiàn)催產(chǎn)成功率低,受精率低等問題,嚴(yán)重影響人工繁殖效果。血液性類固醇激素,如睪酮(Testosterone)和雌二醇(Estradiol)與魚類性腺發(fā)育具有顯著相關(guān)性,能夠反映多種魚類的生殖狀況,準(zhǔn)確判定魚類性別和性腺發(fā)育期。因此有必要利用血液睪酮和雌二醇水平連續(xù)監(jiān)測中華鱘生殖狀態(tài),有效篩選養(yǎng)殖環(huán)境下的性成熟個體。以中華鱘全血為檢測對象,雌二醇和睪酮為檢測目標(biāo)。前處理過程采用乙腈提取,N-丙基乙二胺(Primary secondary amine,PSA)凈化,檢測過程采用高效液相色譜-熒光法(High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence,HPLC-FLD)檢測血液雌二醇,高效液相色譜-質(zhì)譜法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)檢測血液睪酮。結(jié)果表明,雌二醇在0.5~50 ng/mL的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.528x-0.1325,相關(guān)性良好(R~2=0.999),檢測限0.40 ng/mL;睪酮在0.1~5.0 ng/mL的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.4978x+0.0339,R~2=0.999,檢測限0.05 ng/mL。兩種回收率均在80%~120%,出峰時間基本一致,精密度良好,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation,RSD)均小于2%。該方法采用全血,節(jié)約樣品,并可滿足中華鱘成體血液雌二醇和睪酮水平的檢測。以9~17齡養(yǎng)殖中華鱘為對象,利用B超儀采集性腺發(fā)育圖像,通過提取鰭條基因組DNA,擴(kuò)增性別特異性條帶,采用高效液相色譜及其質(zhì)譜聯(lián)用法檢測血液雌二醇和睪酮水平。得到以下結(jié)果:9~17齡養(yǎng)殖中華鱘性腺發(fā)育大部分(77.66%)處于Ⅱ期,Ⅲ期、Ⅳ期約占22.34%;雌性中華鱘基因組DNA出現(xiàn)特異性條帶;養(yǎng)殖中華鱘性腺最早9齡時向Ⅲ期發(fā)育,同一年齡不同性別的中華鱘,其性腺發(fā)育期不完全一致;雌鱘血液雌二醇、睪酮水平變化基本一致,不同年齡段睪酮平均水平較低,雌二醇水平高于睪酮,最高超過7.000 ng/mL;雄鱘血液睪酮水平變化趨勢明顯,最低的濃度小于2.000 ng/mL,最高濃度接近8.000 ng/mL,雌二醇維持在較低水平(低于1.000 ng/mL)且基本不變。對養(yǎng)殖中華鱘繁殖周期,及特定年齡的發(fā)育期,暫無法定論,需要根據(jù)大量樣品,結(jié)合多種判定方法,進(jìn)一步總結(jié)規(guī)律,準(zhǔn)確判斷其發(fā)育期,通過養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)等進(jìn)一步驗(yàn)證。以中華鱘和長江鱘(Acipenser dabryanus)尿液為檢測對象,應(yīng)用高效液相色譜-熒光法檢測L-色氨酸。尿液樣品經(jīng)甲醇、乙腈提取,ENVI-18固相萃取小柱凈化,在熒光波長λ_(ex)=285 nm,λ_(em)=353 nm等色譜條件,得到L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與其質(zhì)量濃度關(guān)系,檢出限(LOD)為0.005μg/mL,定量限(LOQ)為0.020μg/mL,L-色氨酸加標(biāo)回收率在80%~120%。檢測結(jié)果表明,這種首次建立的檢測長江鱘科魚類芳香族氨基酸的方法可靠,能夠應(yīng)用于魚類生物基質(zhì)具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的檢測。本研究建立的高效液相色譜及其質(zhì)譜聯(lián)用法可有效檢測中華鱘血液雌二醇和睪酮,高效液相色譜熒光法能夠檢測鱘魚尿液L-色氨酸,將為進(jìn)一步掌握養(yǎng)殖中華鱘性腺發(fā)育規(guī)律提供檢測方法,從而有效篩選性成熟親魚。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S931
【部分圖文】：

結(jié)果見表 2-4。峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 0.04%～平均值（6.011±0.025）min，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 0.42%。加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)每個水平平行測 5 次，回收率結(jié)果見表 2-2。107.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 5.32%～8.73%。鱘血液雌二醇和睪酮檢測結(jié)果鱘血液雌二醇檢測結(jié)果見圖 2-1，a 為雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品 1、2、5、，b 為其中一尾中華鱘全血液相檢測色譜圖。圖 2-1 中 a 結(jié)果顯的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間一致，峰面積以一定關(guān)系增加，樣品峰，出峰時間相差不足 0.1 s，且 1 min 內(nèi)無雜峰出現(xiàn)，表明中定濃度的雌二醇。鱘血液睪酮檢測結(jié)果見圖 2-2，左邊是睪酮標(biāo)樣（0.5 ng/mL）液邊是中華鱘血液檢測出峰圖，四個峰從上到下依次是母離子（97.200），子離子（109.100）和內(nèi)標(biāo)（甲基睪酮-D3）。標(biāo)樣和華鱘血液中有一定水平的睪酮。

圖 2-2 睪酮標(biāo)準(zhǔn)品（0.5 ng/mL）和中華鱘血液目標(biāo)物液質(zhì)出峰圖Fig.2-2 Liquid chromatography mass spectrometry of Testosterone standard (0.5 ng/mL) and Asinensis blood target.5 討論.5.1 樣品前處理方法的優(yōu)化樣品前處理過程的提取步驟選取了甲醇、乙腈和乙酸乙酯三種常用有機(jī)試劑化步驟，選擇了 HLB 固相萃取柱、C18 固相萃取柱[54]以及吸附劑 PSA，并考九種組合的處理效果。結(jié)果表明，乙腈提取，PSA 凈化組合，前處理效果比。血液是一種比較復(fù)雜的基質(zhì)，若將其簡單化，分為有機(jī)成分和無機(jī)成分。實(shí)驗(yàn)影響較大的是有機(jī)物中含量較高的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)。因此，選擇三種去除蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的常用試劑，其極性分別為甲醇 6.6，乙腈 6.2，乙酯 4.3。雌二醇和睪酮的極性更接近于乙腈的極性，根據(jù)相似相溶原理，目更易與乙腈互溶，粉末狀PSA與HLB固相萃取柱均為正向萃取，吸附極性雜質(zhì)

圖 3-2 9～15，17 齡中華鱘性腺發(fā)育期Fig.3-2 9-15, 17-year-old A. sinensis gonad development別鑒定結(jié)果驗(yàn)鑒定了 9～15，17 齡中華鱘性別，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)中雄性 45 尾性別特異基因僅存在于雌性中華鱘，因此，電泳結(jié)果為條帶單一的的雄性，如圖 3-3，DNA Marker 左側(cè)是有特異性條帶的是雌性，右?guī)У氖切坌�。根�?jù)電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)出每個年齡組的性別比例，如圖組雌雄比例在 0.38～3.5 之間，所有個體雌雄比例 38：45，比例大于圖 3-3 中華鱘性別鑒定結(jié)果Fig.3-3 Results of A. sinensis gender identification90100）

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本文編號：2819281