本實(shí)驗(yàn)采用巢氏PCR方法和RACE PCR技術(shù)分別克隆得到褶紋冠蚌i型溶菌酶基因(CpLYZ3)的cDNA序列,三角帆蚌噬菌體型溶菌酶基因(HcPLYZ)的cDNA序列�？寺〉玫降腃pLYZ3 cDNA長(zhǎng)為968bp,其中5'非編碼區(qū)(UTR)為395bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)含有432bp,3'非編碼區(qū)(UTR)為141bp,編碼143個(gè)氨基酸殘基,推導(dǎo)的蛋白分子量為15.6KD,等電點(diǎn)為6.09,通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白含有由17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。從多序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因具有i型溶菌酶基因中的一些保守功能位點(diǎn):Glu61和Asp72,并且與其它的i型溶菌酶基因序列同源性較高27-87%,初步斷定該序列屬于i型溶菌酶基因。通過(guò)對(duì)CpLYZ3基因在褶紋冠蚌不同組織中的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn):CpLYZ3的mRNA表達(dá)在血淋巴、肝胰腺、外套膜、肌肉和鰓組織中存在差異。CpLYZ3在肝胰腺中的表達(dá)量是最高的,其次是在外套膜和鰓中,而在肌肉中表達(dá)量最低。分別用嗜水氣單胞菌和肽聚糖刺激后,在血淋巴、肝胰腺和鰓組織中表達(dá)量均升高,在肝胰腺中表達(dá)量變化最明顯,分別是空白對(duì)照的32倍和14.2倍。說(shuō)明該溶菌酶主要在褶紋冠蚌肝胰腺中起作用。將褶紋冠蚌CpLYZ3序列與表達(dá)載體PET-30a(帶有組氨酸標(biāo)簽)連接,成功構(gòu)建了 PET-30a-LYZ3原核表達(dá)質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株后,誘導(dǎo)得到大量融合蛋白。經(jīng)分析確認(rèn)所獲得的重組蛋白在21KD左右,與預(yù)測(cè)蛋白大小一致。HcPLYZ基因序列全長(zhǎng)為829bp,其中5'UTR(非編碼區(qū))長(zhǎng)度為97 bp;開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為468bp;3'UTR長(zhǎng)度為264bp,編碼154個(gè)氨基酸。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),該蛋白N端沒(méi)有信號(hào)肽。推導(dǎo)的蛋白分子量為17.6KD,等電點(diǎn)為5.89。推導(dǎo)的HcPLYZ氨基酸序列中包含2個(gè)高度保守的噬菌體型溶菌酶活性位點(diǎn)(Glu20和Asp29)。將三角帆蚌血淋巴、肝胰腺、鰓和外套膜這四個(gè)組織上洗脫下來(lái)的微生物涂平板,然后挑取菌落進(jìn)行PCR,發(fā)現(xiàn)這些微生物中也存在HcPLYZ基因,因此初步推測(cè)HcPLYZ是從三角帆蚌體內(nèi)共生菌中克隆得到。通過(guò)對(duì)HcPLYZ基因在三角帆蚌不同組織中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),在血淋巴、肝胰腺、外套膜、肌肉和鰓組織中均有表達(dá)。用嗜水氣單胞菌刺激后,在血淋巴、肝胰腺和鰓組織中表達(dá)量均升高,在鰓中表達(dá)量變化最明顯。說(shuō)明該溶菌酶在三角帆蚌免疫反應(yīng)中起到重要的作用。將三角帆蚌HcPLYZ序列與表達(dá)載體PET-30a(帶有組氨酸標(biāo)簽)連接,成功構(gòu)建了 PET-30a-LYZ3原核表達(dá)質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株后,誘導(dǎo)并成功表達(dá)出重組蛋白。通過(guò)Ni2+螯和層析法獲得了純化的蛋白。另外,以溶壁微球菌為底物,檢測(cè)到重組HcPLYZ的最適pH為5.5,最適溫度為50℃。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S944.1
【部分圖文】：

圖１＿１機(jī)體的非特異性免疫系統(tǒng)的組成逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ｓｙｓｔｅｍ．逡逑２逡逑

和Ｎ－乙酰氨基葡萄糖（ＮＡＧ）之間的Ｐ－１，４糖苷鍵，通過(guò)水解糖苷鍵，使糖從逡逑不溶性變成可溶性，在細(xì)胞內(nèi)滲透壓的作用下使得細(xì)菌裂解＞２２］。然而，革蘭氏逡逑陰性菌表面有一層脂多糖（如圖１－２所示），所以溶菌酶對(duì)其并不能直接作用［２３］。逡逑但對(duì)于這層障礙來(lái)說(shuō)，機(jī)體能通過(guò)非特異性免疫的其它成分（如防御素和乳鐵逡逑蛋白等）“松動(dòng)”外膜，然后進(jìn)入使其糖鏈裂解。逡逑而對(duì)于噬菌體型溶菌酶來(lái)說(shuō)，初期的研宄也認(rèn)為其能高效的破壞細(xì)菌細(xì)胞逡逑壁上肽聚糖中的Ｐ－１．４糖苷鍵引起細(xì)菌細(xì)胞死亡［２４］。通過(guò)對(duì)噬菌體型溶菌酶三維逡逑結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白在Ｃ端含有４個(gè)ａ螺旋結(jié)構(gòu)域（ａｌ，0２，0３和ａ４），逡逑其中ａ４是典型的雙親性螺旋機(jī)構(gòu)，它帶的正電荷在與帶負(fù)電荷的抑菌細(xì)胞膜進(jìn)逡逑行相互識(shí)別和作用過(guò)程中起到重要的作用，從而干擾了細(xì)菌細(xì)胞正常的生理代逡逑謝，殺死細(xì)菌［２５］。逡逑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌來(lái)說(shuō)

圖２－１邋ＳＭＡＲＴ技術(shù)原理圖（引自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ技術(shù)手冊(cè)）。逡逑注：ＣＤＳ引物、Ｓｍａｒｔ邋ＩＩ寡核苷酸、ＰＣＲ引物都有一段相同的序列．邋２－１邋Ｔｈｅｏｒｙ邋ｃｈａｒｔ邋ｏｆ邋ＳＭＡＲＴ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋（ｆｒｏｍ邋Ｃｌｏｎｔｅｃｈ邋ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｍａｎｕａｈｅ邋ＣＤＳ，邋Ｓｍａｒｔ邋ＩＩ邋ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ａｎｄ邋ＰＣＲ邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｃｏｎｔａｉｎｅｄ邋ａ邋ｓｔｒｅｔｃｈ邋ｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅ．逡逑

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本文編號(hào)：2819423