墨西哥灣扇貝(Argopecten irradians concentricus)是中國(guó)南方海域養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)雙殼貝,1991年引進(jìn)至今,經(jīng)歷了20多年小群體繁育養(yǎng)殖,種質(zhì)退化嚴(yán)重。引進(jìn)新的遺傳資源,取得墨西哥灣扇貝種質(zhì)遺傳改良研究的突破性進(jìn)展是實(shí)現(xiàn)其養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的根本。扇貝“渤海紅”為中國(guó)北方海域重點(diǎn)推廣養(yǎng)殖的新品種,課題組已于2015年9月從山東引進(jìn)扇貝“渤海紅”,并與本課題組選育的“墨西哥灣扇貝大閉殼肌新品系”進(jìn)行了雜交,小試獲得成功,其雜交可行性和形態(tài)雜種優(yōu)勢(shì)均已被證實(shí),但相關(guān)分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)還比較薄弱。因此,本研究圍繞墨西哥灣扇貝及其與扇貝“渤海紅”雜交F1代的分子遺傳學(xué)鑒定和評(píng)估,開展了以下研究:1、墨西哥灣扇貝轉(zhuǎn)錄組Illumina測(cè)序及生物信息學(xué)分析基于Illumina Hi Seq~(TM)2000平臺(tái),對(duì)2組生長(zhǎng)速率不同的5月齡墨西哥灣扇(普通養(yǎng)殖群體)進(jìn)行RNA-seq測(cè)序,獲得109 911條高質(zhì)量Unigenes,平均長(zhǎng)度為1452 bp,其中50 433條(45.89%)Unigenes獲得注釋。根據(jù)FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1的原則,篩選出9 901個(gè)差異表達(dá)基因,隨機(jī)選擇9個(gè)差異基因進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,q PCR基因表達(dá)的整體趨勢(shì)與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果呈線性相關(guān)(R2=0.9193),初步說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)τ诨虮磉_(dá)趨勢(shì)的預(yù)測(cè)是準(zhǔn)確的。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路及GO功能富集分析,篩選到了TGF-β、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等幾個(gè)參與細(xì)胞增殖和分化的重要通路;差異基因在GO分類中的覆蓋面較廣,說明墨西哥灣扇貝的生長(zhǎng)是生物學(xué)過程的全方位響應(yīng)。研究結(jié)果為墨西哥灣扇貝生長(zhǎng)相關(guān)基因挖掘、生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制揭示及分子標(biāo)記開發(fā)等提供了理論支撐。2、基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的墨西哥灣扇貝生長(zhǎng)相關(guān)基因及SNPs篩選生長(zhǎng)相關(guān)基因是指在細(xì)胞分化及成熟或組織生長(zhǎng)及重構(gòu)方面起促進(jìn)或抑制作用的一類基因。本研究基于Blast比對(duì)、GO和KEGG多種數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,從墨西哥灣扇貝比較轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因中篩選出38個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因,涉及肌肉生長(zhǎng)蛋白、消化酶和生長(zhǎng)因子及其受體等18個(gè)類別。通過PCR擴(kuò)增直接測(cè)序法對(duì)墨西哥灣扇貝轉(zhuǎn)錄組Unigene23250和CL4903.Contig2序列上預(yù)測(cè)到的潛在SNP位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,共檢測(cè)到5個(gè)中度多態(tài)SNPs(0.25PIC0.50),包含4個(gè)轉(zhuǎn)換和1個(gè)顛換。CL4903.Contig2序列上的3個(gè)完全連鎖位點(diǎn)(A-6167-T、G-6178-A、G-6185-A)與Unigene23250序列上的G-1142-A位點(diǎn)發(fā)生非同義突變。對(duì)已鑒定的SNP與體質(zhì)量、閉殼肌重、殼長(zhǎng)、殼寬和殼高的相關(guān)性進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果顯示,Unigene23250 G-1142-A位點(diǎn)AA基因型在體質(zhì)量、閉殼肌重及殼長(zhǎng)、殼寬和殼高上的均值都顯著高于AG和GG基因型(P0.05),但AG和CG基因型在這5個(gè)性狀上的差異不顯著(P0.05)。CL4903.Contig2的G-6085-A位點(diǎn)AA基因型的體質(zhì)量及閉殼肌重均值顯著高于AG和GG基因型(P0.05),但這兩個(gè)位點(diǎn)不同基因型間形態(tài)性狀差異不顯著(P0.05)。推斷AA為優(yōu)勢(shì)基因型。研究結(jié)果表明,基于墨西哥灣扇貝轉(zhuǎn)錄組篩選到的這幾個(gè)SNP位點(diǎn)具有用于生長(zhǎng)性狀分子輔助選育的潛力。3、墨西哥灣扇貝與扇貝“渤海紅”SSR開發(fā)及其雜交F1代驗(yàn)證為對(duì)墨西哥灣扇貝與扇貝“渤海紅”雜交F1代進(jìn)行分子遺傳學(xué)鑒定和評(píng)估,本研究以墨西哥灣扇貝普通養(yǎng)殖群體40個(gè)個(gè)體對(duì)其轉(zhuǎn)錄組查找到的117個(gè)潛在SSR進(jìn)行篩選。結(jié)果有26個(gè)為多態(tài)位點(diǎn)(22.2%),其中21個(gè)(80.77%)在扇貝“渤海紅”中通用;多態(tài)位點(diǎn)主要為二堿基、6重復(fù),擴(kuò)增效率最高的是AT。隨機(jī)選擇8個(gè)多態(tài)SSR對(duì)扇貝“渤海紅”和墨西哥灣扇貝兩群體的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示,墨西哥灣扇貝群體的遺傳多樣性低于扇貝“渤海紅”群體,兩個(gè)群體的遺傳距離為0.348,兩者雜交能產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)。開發(fā)3個(gè)扇貝“渤海紅”與墨西哥灣扇貝特異SSR,利用這3個(gè)特異SSR對(duì)40個(gè)扇貝“渤海紅”和墨西哥灣扇貝雜交F1代個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證,3個(gè)特異SSR在F1代中的擴(kuò)增片段均不重疊,且同時(shí)存在來自墨西哥灣扇貝和扇貝“渤海紅”的特異等位基因,也未出現(xiàn)非親本之外的條帶,證明這些子代均為墨西哥灣扇貝和扇貝“渤海紅”的雜交子代。
【學(xué)位單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 2-1 RNA 提取步驟Fig.2-1 The procedure RNA extraction構(gòu)建、Illumina 測(cè)序和 De novo 組裝格后，2 組樣品各取 1 μg 用于轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建。具體方re Beads富集真核生物mRNA，采用高溫和金屬離子作用mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合A 為模板合成二鏈 cDNA[78]，再用 VAHTSTM DNAC(3)純化的雙鏈 cDNA 先進(jìn)行末端修復(fù)及加 A 尾操作，然TSTMDNA Clean Beads 進(jìn)行片段大小分選[79]；(4)最后STM DNA Clean Beads 純化 PCR 產(chǎn)物，得到最終的文gilent 2100 Bioanalyzer 進(jìn)行質(zhì)檢。格后在 Illumina HiSeq 2000 平臺(tái)上進(jìn)行 6G 數(shù)據(jù)量測(cè)的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)，刪除接頭和低質(zhì)量 Reads， Trinity 軟件對(duì)高質(zhì)量 Clean reads 進(jìn)行 De novo 組裝[8gicl將其去冗余和進(jìn)一步拼接、同源轉(zhuǎn)錄本聚類，得到最

圖 2-2 De novo 組裝流程Fig.2-2 The process of De novo assemblynigene 功能注釋組裝得到的 Unigene 在六大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，并分別對(duì)注釋到每個(gè)注釋上的 Unigene 數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。六大數(shù)據(jù)庫(kù)分別為：非冗余蛋白序列、非冗余核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù) (Nt)、高質(zhì)量非冗余的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù) (Swiss-P理基因組、生物通路、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)之間聯(lián)系的集成數(shù)據(jù)庫(kù)(K源家族蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(COG)和 GO 數(shù)據(jù)庫(kù)。差異表達(dá)基因篩選過 FPKM 計(jì)算法[82]對(duì) Unigene 表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后使用 DEGseq 軟樣本間相同基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，并以 FDR(false discovery rate2Fold≥1(快速生長(zhǎng)組/慢速生長(zhǎng)組)為閾值，篩選差異表達(dá)基因(Differesed unigene)。FPKM[82]是目前計(jì)算基因表達(dá)量最常用的方法，其是指每中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的 Fragment 數(shù)目。其計(jì)算公式為： =106 3公式 (2-1)

LabchipGX檢測(cè)膠圖

【參考文獻(xiàn)】

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1 王忠良;丁q

本文編號(hào)：2819115