牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類,雌性個(gè)體的生長(zhǎng)速度明顯快于雄性個(gè)體,因而關(guān)于牙鲆性別分化及生殖調(diào)控的研究成為目前研究的熱點(diǎn)。Kisspeptin/Gpr54系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其鑒定是神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的一項(xiàng)重大突破,也是脊椎動(dòng)物生殖研究領(lǐng)域的一場(chǎng)新革命。目前關(guān)于Kisspeptin系統(tǒng)的研究主要集中在哺乳類動(dòng)物,在魚類中的研究?jī)H僅處于起步階段,而在牙鲆中仍未見報(bào)道。因此,本研究克隆了牙鲆kiss2及其受體gpr54-2基因,檢測(cè)了二者在牙鲆早期發(fā)育階段及成體各組織的表達(dá)情況;運(yùn)用western-blot和免疫組化方法檢測(cè)了Gpr54-2蛋白在牙鲆腦、性腺和肝臟組織中的表達(dá)情況,以期為進(jìn)一步闡明kiss2基因在牙鲆生殖中的作用提供基礎(chǔ)。其主要結(jié)果如下:1牙鲆kiss2及其受體gpr54-2基因的分子鑒定從牙鲆腦組織中克隆得到牙鲆kiss2及其受體gpr54-2基因c DNA序列。其中獲得的牙鲆kiss2c DNA長(zhǎng)度為449 bp,該序列包括一段83 bp的3'非翻譯區(qū)和一段編碼121個(gè)氨基酸殘基的366 bp開放閱讀框;牙鲆gpr54-2 c DNA全長(zhǎng)為2556bp,該序列包括1143bp的開放閱讀框,899bp的5'非翻譯區(qū)(UTR)及504bp的3'非翻譯區(qū),編碼380個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,牙鲆Kisspeptin與脊椎動(dòng)物Kisspeptin-2聚為一支;牙鲆Gpr54-2魚類Gpr54-2聚為一支。氨基酸相似性分析表明,牙鲆Kisspeptin2與條紋鱸(Morone saxatilis)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)及斑馬魚(Danio rerio)Kisspeptin2的同源性分別為76%、74%、69%和28%。牙鲆Gpr54-2與大西洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossus)、塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)及斑馬魚(Danio rerio)的Gpr54-2的同源性分別為98%、93%和88%。2 kiss2及gpr54-2在牙鲆成體各組織的表達(dá)分布采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了kiss2及其受體gpr54-2基因在牙鲆成體各組織的表達(dá)分布情況。其中牙鲆kiss2基因在腦中的表達(dá)量最高,在肝、鰓、腸和卵巢中次之,在肌肉、精巢和心臟中的表達(dá)量較低,而在胃和腎中沒(méi)有檢測(cè)到kiss2基因的表達(dá)。而gpr54-2基因在所檢測(cè)的牙鲆組織包括腦、肌肉、心臟、鰓、腎、胃、肝臟、腸、性腺中都有表達(dá),但表達(dá)量差異很大。其中g(shù)pr54-2在牙鲆腦組織中的表達(dá)量最高,其次是性腺組織,且在卵巢的表達(dá)量稍高于精巢,而在其它組織中的表達(dá)量則相對(duì)較低。kiss2及其受體gpr54-2在牙鲆腦中的豐富表達(dá)及在精卵巢中的較高表達(dá)表明二者很有可能與牙鲆神經(jīng)系統(tǒng)和生殖發(fā)育相關(guān)。3 kiss2及gpr54-2在牙鲆早期不同發(fā)育階段的表達(dá)圖式實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示,在牙鲆未受精卵沒(méi)有檢測(cè)到kiss2的表達(dá),且在胚胎發(fā)育期間均保持較低的表達(dá)水平。而在孵化后仔魚中kiss2基因的表達(dá)量明顯升高,至孵化后第29天(29 dph)達(dá)到高峰。gpr54-2基因在牙鲆胚胎及仔魚階段都有表達(dá),在胚胎發(fā)育早期其表達(dá)量相對(duì)較低,而在孵化后仔魚中表達(dá)量升高。至孵化后第36天(36 dph)達(dá)到高峰。這些結(jié)果表明kiss2及其受體gpr54-2基因在牙鲆早期發(fā)育階段的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。4 Gpr54-2蛋白在牙鲆成體組織中的表達(dá)情況采用多肽親和法制備了牙鲆Gpr54-2蛋白多克隆抗體。應(yīng)用該抗體,Western-blot結(jié)果顯示,Gpr54-2蛋白在牙鲆腦、精巢和卵巢中均有明顯的表達(dá),而在牙鲆肝組織中僅有較弱的表達(dá)。但應(yīng)用該抗體的免疫組化結(jié)果顯示各組織信號(hào)不明顯,表明該抗體可能不適用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果為后續(xù)深入探討kiss2及其受體gpr54-2基因在牙鲆性別分化及生殖的作用打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

子量為 13.7 KD。通過(guò) BioEdit 軟件分析，在其第五和第十五個(gè)氨基酸之間有一個(gè)典型的疏水性區(qū)域。圖2-1 牙鲆kiss2基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列＿表示信號(hào)肽；*表示終止密碼子；□表示加尾信號(hào)和Kisspeptin-10序列；◇表示蛋白水解切割位點(diǎn)Fig.2-1 Nucleotide and deduced amino acids sequences of P. olivaceus kiss2The putative signal peptide is underlined. The stop codon (TGA) is shown by asterisks (*). Thepolyadenylation signal (AATAAA) and putative Kisspeptin-10 region (FNYNPLTLRF) are boxed. Theproteolytic cleavage site (GKR) is marked as diamond.通過(guò)氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，牙鲆 kiss2 與條紋鱸（Morone saxatilis）的同源性最高，為 76%，接著是歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax），為 74%；與帶點(diǎn)石斑魚（Epinephelus coioides）、（羅非魚（Oreochromis niloticus）和塞內(nèi)加爾鰨（Soleasenegalensis）的同源性依次為 72%、70%和 69%。而其與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）、鯽魚（Casrassius auratus）的同源性較低，依次為為 34%、28%和 25%，與巴西烏龜（Trachemys scripta elegans）和非洲爪蟾（Xenopus siluranatropicalis）的同源性也僅為 24%。然而，Kisspeptin-10 片段區(qū)域在脊椎動(dòng)物中高度

圖 2-2 牙鲆 kiss2 氨基酸序列比對(duì)分析顏色不同表示保守性不同；Kisspeptin-10區(qū)域用紅色的方框標(biāo)示。Fig.2-2 Alignment of amino acid sequences of P. olivaceus kiss2 and other species kiss2The identical, highly and less conserved amino acid residues are indicated by different colors,respectively. The Kisspeptin-10 regions are shown in boxes (color red).系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，脊椎動(dòng)物 Kisspeptins 分為兩支，即 Kisspeptin-1 和Kisspeptin-2。牙鲆 Kisspeptin 與脊椎動(dòng)物 Kisspeptin-2 聚為一支（圖 2-3）。

23圖 2-3 kiss1和kiss2氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2-3 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences of vertebrate kiskiss2 genes..3 牙鲆 gpr54-2 基因的克隆以牙鲆腦組織 RNA 為模板，首先進(jìn)行 gpr54-2 部分 cDNA 片段的 PCR 到長(zhǎng)度分別為 638bp、234bp 和 138bp 的 EST 序列；通過(guò) 3'-RACE PCR 得 793 bp 的序列，通過(guò) 5'-RACE PCR 得到長(zhǎng)度為 1114bp 的序列。經(jīng)過(guò)拼接長(zhǎng)度為 2556bp 的牙鲆 gpr54-2 cDNA 全長(zhǎng)序列（圖 2-4）。該序列包括 1143放閱讀框，899bp 的 5'非翻譯區(qū)（UTR）及 504bp 的 3'非翻譯區(qū)，編碼 380酸。其蛋白具有 7 個(gè)跨膜區(qū)域。經(jīng)預(yù)測(cè)其氨基酸理論等電點(diǎn)為 9.01，分子0KD。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2817820