羅非魚是世界上最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一,具有生長快、繁殖力高、適應(yīng)性強(qiáng)和食性廣等優(yōu)點(diǎn),已在世界各地進(jìn)行了廣泛引種與養(yǎng)殖。但是自2009年以來,羅非魚鏈球菌病在羅非魚養(yǎng)殖中大規(guī)模暴發(fā)且頻繁發(fā)生與流行,給羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。培育羅非魚抗病品系是解決羅非魚鏈球菌病害的重要途徑之一。分子標(biāo)記輔助育種是一種高效的育種方法,利用分子標(biāo)記可以定向選育羅非魚抗病品系,增加選育強(qiáng)度從而加速其遺傳改良進(jìn)程。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)因具有標(biāo)記數(shù)量多且易于檢測等特點(diǎn)成為MAS中最為常用的分子標(biāo)記。Ikaros是一種C2H2型鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)淋巴細(xì)胞的正確發(fā)育及其免疫功能的正常發(fā)揮具有重要作用,但其在羅非魚中的研究還未見相關(guān)報(bào)道。因此,開展尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)免疫相關(guān)候選基因Ikaros基因的相關(guān)功能研究,并從中篩選抗病相關(guān)SNP分子標(biāo)記,這可為實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助羅非魚抗病選育奠定基礎(chǔ)。本研究對(duì)尼羅羅非魚Ikaros基因的cDNA序列和基因組DNA序列進(jìn)行了克隆,對(duì)基因的結(jié)構(gòu)特征、組織分布及其對(duì)無乳鏈球菌感染的響應(yīng)進(jìn)行分析,初步了解Ikaros基因的生物學(xué)功能;對(duì)Ikaros基因5'調(diào)控區(qū)序列中的SNPs進(jìn)行檢測,并與無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)抗性進(jìn)行相關(guān)性分析,以期獲得抗病相關(guān)的SNPs,為尼羅羅非魚遺傳育種研究提供新的分子標(biāo)記,研究結(jié)果具體如下:1.尼羅羅非魚Ikaros基因的克隆與組織表達(dá)本試驗(yàn)采用RT-PCR和RACE等方法克隆了尼羅羅非魚Ikaros基因的cDNA序列以及利用PCR和染色體步移技術(shù)克隆了Ikaros的基因組DNA序列。對(duì)Ikaros基因序列分析發(fā)現(xiàn),Ikaros基因組DNA為20454 bp,包括7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子,經(jīng)可變剪接可形成6種不同的mRNA剪接異構(gòu)體,其編碼的氨基酸序列均具有Ikaros家族典型的鋅指結(jié)構(gòu)域且與硬骨魚類Ikaros氨基酸序列同源性較高(70.6%~93.7%)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了Ikaros mRNA在尼羅羅非魚中的組織分布及其對(duì)無乳鏈球菌感染的響應(yīng)。結(jié)果顯示,Ikaros基因在健康尼羅羅非魚11種被檢測的組織或器官中均有表達(dá),其中在血液中的表達(dá)量最高,其次為胸腺、脾臟和頭腎。人工感染無乳鏈球菌后,血液、胸腺、脾臟、頭腎中Ikaros基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào),并在48h達(dá)到峰值,這表明Ikaros基因參與調(diào)控尼羅羅非魚抵御無乳鏈球菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)。2.尼羅羅非魚Ikaros基因5'調(diào)控區(qū)序列的克隆與分析通過染色體步移法從尼羅羅非魚的基因組中克隆獲得Ikaros基因5'調(diào)控區(qū)序列,長度為4178 bp。使用在線生物信息學(xué)軟件對(duì)Ikaros基因5'調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行預(yù)測與分析,預(yù)測尼羅羅非魚Ikaros基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子(ATG)上游931 bp位置,核心啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-57 bp~48 bp的區(qū)間;預(yù)測的Ikaros基因啟動(dòng)子區(qū)域具有真核生物啟動(dòng)子基本結(jié)構(gòu)元件:TATA框、CCAAT框、八聚體元件等。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測顯示,在Ikaros基因5'調(diào)控區(qū)-2200 bp~1200bp的序列中存在豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),包含GATA-1、Homeobox、CDP CR3+HD、AP-1等。CpG島分析顯示Ikaros基因具有2個(gè)CpG島,分別位于啟動(dòng)子和第一外顯子上。3.尼羅羅非魚Ikaros基因5'調(diào)控區(qū)序列的SNPs及其與無乳鏈球菌抗性的關(guān)聯(lián)分析采用直接測序法在親本(F0)尼羅羅非魚的Ikaros基因5'調(diào)控區(qū)序列中篩查到5個(gè)SNPs,分別將其命名為SNP1(g.562,GA)、SNP2(g.217,GT)、SNP3(g.-53,CT)、SNP4(g.-220,TC)和SNP5(g.-579,TC)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這些SNPs均分布在啟動(dòng)子的各種調(diào)控元件中,可能會(huì)對(duì)Ikaros基因的精確表達(dá)產(chǎn)生重要影響。通過Snapshot方法對(duì)5個(gè)SNPs在子一代(F1)尼羅羅非魚易感群體和抗病群體中進(jìn)行基因分型及與無乳鏈球菌抗性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP2(g.217,GT)、SNP3(g.-53,CT)、SNP4(g.-220,TC)和SNP5(g.-579,TC)的基因型頻率和等位基因頻率在易感群體和抗病群體中存在顯著差異(P0.05),表明這4個(gè)SNPs與無乳鏈球菌抗性顯著相關(guān)。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn),這5個(gè)SNPs可形成一個(gè)單倍塊和5種單倍型,其中GGCTT單倍型與抗病性顯著相關(guān)(P0.05),GGTCT和GTCCC單倍型與易感性顯著相關(guān)(P0.05)。此外,還發(fā)現(xiàn)SNP2(g.217,GT)和SNP5(g.-579,TC)處于完全連鎖狀態(tài)(r2=1,LOD=57.25,D'=1),可作為羅非魚遺傳育種的標(biāo)簽SNP。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曹建萌;胡欣欣;盧邁新;陳瓊;劉志剛;陳昆平;;尼羅羅非魚補(bǔ)體C9基因單核苷酸多態(tài)性及其與抗無乳鏈球菌感染的關(guān)聯(lián)分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2017年03期

2 Yingzhi Fan;Duo Lu;;The Ikaros family of zinc-finger proteins[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2016年06期

3 黃嘉榮;;羅非魚:供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革破產(chǎn)業(yè)瓶頸[J];海洋與漁業(yè);2016年10期

4 卞光明;胡則輝;柴學(xué)軍;王躍斌;胡成碩;;SNP標(biāo)記技術(shù)及其在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)中的應(yīng)用[J];浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2016年04期

5 周遠(yuǎn)揚(yáng);王玉梅;曹俊明;萬忠;李思發(fā);;2015年廣東羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢與對(duì)策建議[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2016年06期

6 于海川;吳嬌;翟鵬飛;姚瑞寧;馬月月;隋娟;;基于CRISPR/Cas9技術(shù)的GATA-1基因敲除K562細(xì)胞系的構(gòu)建[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2016年05期

7 王春曉;盧邁新;高風(fēng)英;劉志剛;曹建萌;朱華平;可小麗;王淼;葉星;葉衛(wèi);;尼羅羅非魚ghrelin基因的多態(tài)性及其與生長性狀相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選[J];水生生物學(xué)報(bào);2016年01期

8 趙海軍;楊彬彬;郝躍;陳榮溢;黎銳恒;岑堅(jiān);陳飛;霍琪;劉建芳;;我國羅非魚出口現(xiàn)狀及對(duì)策[J];食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào);2015年12期

9 付瑞雪;周納宇;劉金相;王旭波;賀艷;張全啟;于海洋;;牙鲆(Paralichthys olivaceus)絲氨酸蛋白酶Ⅰ-1基因多態(tài)性[J];漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展;2015年05期

10 賀立彩;陳尚;朱真鋒;干軍;虞慧敏;;Ikaros的3種亞型對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響[J];中國病理生理雜志;2015年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 任剛;轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑復(fù)合物以及遠(yuǎn)程染色質(zhì)相互作用對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 王海軍;Ikaros和CK2在人類白血病細(xì)胞內(nèi)對(duì)KDM5B表達(dá)調(diào)控的研究[D];吉林大學(xué);2014年

3 李風(fēng)鈴;魚類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的早期發(fā)生以及Ikaros基因的克隆和表達(dá)[D];中國海洋大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 胡欣欣;尼羅羅非魚補(bǔ)體C9和穿孔素基因的克隆及其與鏈球菌病抗性相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選[D];上海海洋大學(xué);2016年

2 解麗然;IKZF1和AFF3基因多態(tài)性與中國1型糖尿病及自身免疫性甲狀腺疾病的關(guān)聯(lián)[D];吉林大學(xué);2016年

3 邢賀飛;半滑舌鰨抗病相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選及兩種免疫相關(guān)基因的克隆與初步分析[D];上海海洋大學(xué);2015年

4 王文靜;草魚3個(gè)Toll樣受體基因克隆和表達(dá)及與細(xì)菌性敗血癥關(guān)聯(lián)分析[D];上海海洋大學(xué);2014年

5 劉敬文;凡納濱對(duì)蝦免疫基因SNPs開發(fā)及其與WSSV抗性的關(guān)聯(lián)分析[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2014年

6 馬瑞芹;牙鲆三種細(xì)胞色素P450酶基因SNP與繁殖內(nèi)分泌相關(guān)性分析[D];中國海洋大學(xué);2012年

7 欒海霞;中國漢族人群C1qA、IKZF1單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

8 劉揚(yáng)聲;ETS1、IKZF1基因多態(tài)性與漢族人系統(tǒng)性紅斑狼瘡表型的相關(guān)性研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

9 孔令敏;CD147啟動(dòng)子CpG島甲基化的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2818872