【摘要】：草魚(Ctenopharyngodon idellus)為我國淡水經(jīng)濟(jì)魚類中產(chǎn)量最大的種類,其性成熟個體較大(10kg),性成熟周期較長,目前還沒有育成優(yōu)良品種。傳統(tǒng)的育種方式需要較高的成本和較長的時(shí)間,草魚基因組中存在大量未知功能的主效基因,解讀它們的功能對認(rèn)識草魚生殖、生長、發(fā)育及抗逆(病)等經(jīng)濟(jì)性狀具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值�；瘜W(xué)誘變已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和蔬菜育種中,由于魚類體外受精的特點(diǎn),使其能夠在不同時(shí)期開展誘變獲得突變體。目前,魚類化學(xué)誘變主要采用突變能力強(qiáng)的烷化劑。在模式生物斑馬魚中,ENU誘變能夠產(chǎn)生各式突變性狀的功能突變體。ENU化學(xué)誘變應(yīng)可用于養(yǎng)殖魚類的遺傳育種,以增加養(yǎng)殖魚類的基因遺傳突變率。本研究以0.1~2.0mmol等不同濃度的ENU溶液處理草魚受精卵15min,在胚胎體節(jié)期的畸形率分別為20.3%~78.5%,胚胎畸形率與ENU濃度成正相關(guān);出苗存活率則從86.3%~17.2%,與ENU濃度成負(fù)相關(guān)。最后選用0.5mmol濃度ENU溶液處理大量處理受精卵,受精后產(chǎn)生的子代在體節(jié)期胚胎畸形率約為50%,約50%的子代形態(tài)發(fā)育正常,生長速度產(chǎn)生差異,可供篩選出性狀優(yōu)良的突變個體。通過提取20尾1+齡誘變F1子代的基因組DNA,對4個生長發(fā)育通路相關(guān)基因mstn-1、mstn-2、fst-1、fst-2的部分閱讀框進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增和測序。結(jié)果顯示,ENU能夠高效誘導(dǎo)草魚基因組產(chǎn)生單核苷酸突變,ENU對上述4個基因的平均誘變率為0.13%,表明ENU溶液浸泡受精卵可提高草魚基因組突變效率,進(jìn)而應(yīng)用于草魚的遺傳改良。成纖維細(xì)胞生長因子受體類似物1(Fibroblast growth factor receptor like 1,FGFRL1)是近期發(fā)現(xiàn)的FGFRs家族中的一員。FGFRL1是一類缺少細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的生長因子受體,研究表明它在細(xì)胞增殖、肌肉骨骼系統(tǒng)發(fā)育等方面有重要的作用。本研究采用c DNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)克隆了草魚fgfrl1a/-1b重復(fù)基因全長c DNA序列。草魚fgfrl1a和fgfrl1b基因全長分別為3405bp和2666bp,開放閱讀框分別為1461bp和1458bp,可分別編碼486個和485個氨基酸殘基。與人類和斑馬魚一樣,草魚成熟Fgfrl1a和-1b多肽也包含三個Ig-like結(jié)構(gòu)域,一個跨膜結(jié)構(gòu)域,兩個酪氨酸殘基和一個富含組氨酸的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)。它們都含有6個保守的半胱氨酸殘基。草魚Fgfrl1a和-1b的編碼區(qū)與斑馬魚的相比相似度分別為96%和91%,與人類FGFRL1的相似性較低(分別為66%和59%),但它們之間的相似度僅為56%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,草魚fgfrl1a和-1b基因都在胚胎發(fā)育的受精卵時(shí)期有表達(dá),隨著體節(jié)發(fā)育時(shí)期而表達(dá)量上升,然后呈現(xiàn)下降趨勢。在成年草魚中,fgfrl1a和-1b在所有組織中表達(dá),但組織表達(dá)差異較大,fgfrl1a m RNA在腦、心臟和肌肉中表達(dá)豐富,而fgfrl1b m RNA則在眼、肌肉和鰓中表達(dá)量高。整胚原位雜交結(jié)果顯示,在草魚fgfrl1a m RNA主要在胚胎的腦等神經(jīng)組織和脊索體節(jié)等外胚層和中胚層細(xì)胞組織表達(dá),而fgfrl1b的m RNA在晶狀體和內(nèi)胚層表達(dá)。饑餓處理幼年草魚6天,然后恢復(fù)投喂的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),fgfrl1a和-1b m RNA在肌肉和腦中都在饑餓過程中表達(dá)量升高,第6天達(dá)到最高,隨著恢復(fù)投喂?jié)u漸回到正常水平。h GH處理實(shí)驗(yàn)顯示,fgfrl1a和-1b m RNA表達(dá)量都降低,且降低幅度與注射濃度成正相關(guān)。本研究為深入探索草魚重復(fù)fgfrl1s基因的功能和分子育種奠定了一定的理論基礎(chǔ)。IGFs在進(jìn)化過程中具有高度保守的特點(diǎn),尤其在胚胎、神經(jīng)和骨骼肌的生長發(fā)育,細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化等方面有重要作用。IGFBP-5(Insulin-like growth factor binding protein-5)是IGFBP-家族中最保守的成員,是一個多功能分泌型蛋白質(zhì),能夠增強(qiáng)IGF的功能。本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對草魚成魚不同組織igfbp-5s基因表達(dá)量進(jìn)行研究,所有檢測的組織中igfbp-5a m RNA在肝臟中表達(dá)量最高,其次是腦,在腎臟和眼睛中表達(dá)較高;而igfbp-5b m RNA在所有組織中均有表達(dá),其中在肌肉、腎臟、肝臟、腦和眼睛中表達(dá)量相對較高,其他組織表達(dá)量較低。草魚整胚原位雜交結(jié)果顯示,igfbp-5a m RNA在胚胎發(fā)育過程中主要在體節(jié)和腦中表達(dá),而igfbp-5b m RNA在脊索,體節(jié)和腦中表達(dá)明顯。同樣利用饑餓及恢復(fù)投喂實(shí)驗(yàn)的方法,igfbp-5a和-5b m RNA在不同組織中呈現(xiàn)不同趨勢,在肝臟和肌肉中隨著饑餓表達(dá)量升高而后恢復(fù),在腦中是先降低后升高至正常水平。注射外源h GH后,肌肉中igfbp-5a和-5b m RNA表達(dá)升高,腦中降低。明顯的組織差異說明igfbp-5a和-5b存在功能差異,為進(jìn)一步研究其功能及IGF信號通路奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【圖文】：

10圖 1-1 ENU 誘變后 F1 代孵化期胚胎異常發(fā)育的形態(tài)類型Fig. 1-1 Morphological defects of ENU-treated F1 embryos at hatching stage.1.2.2 ENU 誘變 F1 代突變位點(diǎn)的檢測和誘變頻率對 F1 子代進(jìn)行 ENU 誘變突變位點(diǎn)和誘變頻率的檢測，每組分別提取來自 20尾 1+齡 ENU 誘變 F1 子代和 5 尾對照組的基因組 DNA。檢測基因?yàn)?fst-1、fst-2、mstn-1、mstn-2 等 4 個草魚肌肉生長發(fā)育相關(guān)基因，利用根據(jù)其部分閱讀框設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)展，電泳檢測清晰（圖 1-2），進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果顯示突變位點(diǎn)數(shù)量和 20 個個體的突變率如表 1-4。在 fst-1、fst-2、mstn-1 和 mstn-2 擴(kuò)增的長度分別為 196bp、173bp、356bp、329bp 的片段中，突變位點(diǎn)的數(shù)量在突變的 F1 代 20 個個體中分別為 7 個、4 個、9 個、6 個，單個基因的突變位點(diǎn)數(shù)平均

頻率為 0.13%；對照組的 F1 子代檢測中未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變（表 1-4）。序列分析顯示，經(jīng)過 ENU 誘變產(chǎn)生的突變位點(diǎn)在基因組 DNA 中主要有以下幾種形式，有 54%（14/26）產(chǎn)生了 A-T 到 G-C 的轉(zhuǎn)換、42%（11/26）為 G-C 到 A-T 的轉(zhuǎn)換、4%（1/26）產(chǎn)生了 G-C 到 C-G 的顛換（圖 1-3，部分結(jié)果未顯示）。

圖 1-3 ENU 誘變 F1 代 mstn-1 和 mstn-2 基因突變位點(diǎn)檢測。A：mstn-1 基因序列，B：mstn-2 基因序列Fig 1-3 Mutation sites at the mstn-1 and mstn-2 locus1.3 討論草魚是我國第一大養(yǎng)殖淡水魚類，目前為止還沒有優(yōu)良品系，草魚育種的目標(biāo)是培育出高產(chǎn)、抗逆的優(yōu)良品種�；瘜W(xué)誘變已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的育種中，且培育出大量新品種。ENU 作為高效的化學(xué)誘變劑在模式動物中已展開不少研究，如在斑馬魚[76]和非洲爪蟾[77]中利用獲得的突變體對功能基因及胚胎發(fā)育機(jī)制的研究已取得一定成果，通過 ENU 誘變得到 myostatin 基因缺失的青淏出現(xiàn)肌纖維肥大及增生的雙肌型[78]，為研究 myostatin 基因的功能提供了有利突變體。然而在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類中缺少相應(yīng)的實(shí)踐及成果。只有前蘇聯(lián)[10]曾采用 ENU 誘變結(jié)合雌核發(fā)育的技術(shù)獲得了鯉魚優(yōu)良突變品系。國內(nèi)韓啟霞[15]等利用 ENU 浸泡方正銀鯽雌雄親本研究 F1 代的誘變率，蔣霞云[16]等已利用 ENU 浸泡草魚精子的方法獲

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓啟霞;常玉梅;梁利群;高國強(qiáng);池炳杰;曹頂臣;孫效文;;ENU誘變銀鯽F_1的遺傳差異分析[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2010年05期

本文編號：2801987