【摘要】：金錢魚(Scatophagus argus)作為一種兼具食用和觀賞價(jià)值的重要養(yǎng)殖魚類,具有典型的雌雄性別二態(tài)性特征。其雌雄生長(zhǎng)差異明顯,雌魚生長(zhǎng)快、個(gè)體大,養(yǎng)殖效益好,而雄魚生長(zhǎng)慢、個(gè)體較小,體色艷麗,觀賞價(jià)值高。金錢魚雌雄發(fā)育不同步,雌魚卵巢成熟時(shí)間比雄魚精巢晚,人工繁殖中難以保證雌雄魚同步性成熟,催產(chǎn)效率低。性別二態(tài)性作為在有性繁殖動(dòng)物中普遍存在的一種生理現(xiàn)象,其形成的部分原因可能與機(jī)體不同基因的差異表達(dá)、性類固醇激素的差異水平和攝食習(xí)性等有關(guān),是多種因素共同參與協(xié)調(diào)的復(fù)雜生長(zhǎng)發(fā)育過程。魚類雌雄性腺具有不同的發(fā)育特征,性別決定后開始分化為精巢或卵巢,使魚類的性腺內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外部形態(tài)表現(xiàn)出明顯的性別二態(tài)性,基因表達(dá)也具有明顯差異。大量研究集中在篩選魚類性腺差異表達(dá)mRNA。本文通過金錢魚性腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,從mRNA水平探索精巢和卵巢差異表達(dá)的基因和富集的信號(hào)通路,測(cè)定血清中性類固醇激素水平,分析性類固醇激素合成相關(guān)基因及其受體基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征。初步回答了血清中性類固醇激素水平差異的原因,為最終解析雌雄二態(tài)性可能的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。其主要結(jié)果如下:1、金錢魚性腺轉(zhuǎn)錄組分析,差異表達(dá)基因和信號(hào)通路的篩選利用RNA-seq技術(shù)對(duì)金錢魚發(fā)育成熟的III期精巢(n=3)和卵巢(n=3)進(jìn)行高通量測(cè)序,在金錢魚雌雄性腺構(gòu)建了cDNA文庫(kù)。經(jīng)de novo拼接組裝后,獲得136,561個(gè)unigene,其與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得大量注釋信息。通過差異篩選條件(|log_2FoldChange|≥2,P-values0.01)得到32,122個(gè)差異表達(dá)基因,其中11,156(34.73%)個(gè)在精巢中高表達(dá),20,966(65.27%)個(gè)在卵巢中高表達(dá)。選擇了20個(gè)顯著的差異表達(dá)基因進(jìn)行定量驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致,證實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可信。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果及在其他魚類的相關(guān)研究,進(jìn)一步篩選到73個(gè)已知功能的性腺差異表達(dá)基因,其中雄性高表達(dá)的53個(gè),如dmrt1,amh,gsdf,wt1a,sox9b和nanos2等;雌性高表達(dá)的20個(gè),如foxl2,sox3,gdf9,bmp15,zar1和figla等。另外,通過基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),篩選到重要的與性別相關(guān)的功能分類信息,包括性別分化(sex differentiation),有性生殖(sexual reproduction),生殖過程(reproductive process),配子形成(gamete generation)和性腺發(fā)育(gonad development)等;且富集到與性別相關(guān)的信號(hào)通路,包括類固醇激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis),卵巢類固醇生成(Ovarian steroidogenesis),PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway),胰島素信號(hào)通路(Insulin signaling pathway)和FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)等信號(hào)通路。2、雌雄魚不同發(fā)育時(shí)期血清中性類固醇激素水平測(cè)定了17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、11-酮基睪酮(11-ketotestosterone,11-KT)和睪酮(Testosterone,T)在雌魚II、III、IV期和雄魚III、IV、V期血清中的水平。結(jié)果表明E2水平在雌魚不同發(fā)育時(shí)期均明顯高于雄魚,且隨著發(fā)育時(shí)期變化其水平呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì),在雌魚IV期達(dá)到最高水平(0.80 ng/mL)。11-KT水平在雄魚不同發(fā)育時(shí)期均高于雌魚,且隨著發(fā)育時(shí)期的變化而逐漸升高,在雄魚V期達(dá)到最高水平(0.47 ng/mL)。T水平在雌魚中高于雄魚,且在雌魚各個(gè)發(fā)育時(shí)期的水平均比雄魚高,在雌魚IV期達(dá)到最高水平(0.41 ng/mL)。T作為合成E2和11-KT的前體物,在E2和11-KT的合成過程中可能起著平衡調(diào)節(jié)作用。雌魚中E2的高水平和雄魚中11-KT的高水平可能對(duì)于維持各自的雌、雄魚性別特征有著重要作用。推測(cè)金錢魚可能受雌、雄激素相對(duì)水平的影響進(jìn)而調(diào)控個(gè)體生長(zhǎng)。3、性類固醇激素合成相關(guān)基因及其受體基因在性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)從轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果中篩選出19個(gè)重要的與性類固醇激素合成通路相關(guān)的基因及其受體基因,分別在卵巢II、III、IV期和精巢III、IV、V期進(jìn)行mRNA定量驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其在雌雄性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平有著明顯的性別差異性。其中StAR1,StAR2,cyp11a1,cyp11b2,cyp19a1b,hsd11b2,hsd3b1,hsd3b7,ar,erα,erβ1和erβ2基因的表達(dá)水平在精巢各個(gè)時(shí)期均高于卵巢;而cyp19a1a,hsd17b1,hsd17b8,hsd17b12和hsd17b14基因的表達(dá)水平在卵巢各個(gè)時(shí)期均高于精巢。其中,cyp11b2作為催化T轉(zhuǎn)化為11-KT的關(guān)鍵基因,其在雄性中的高表達(dá)可能促使11-KT在雄魚中的高水平。而芳香化酶基因cyp19a1a在雌魚各個(gè)時(shí)期的高表達(dá),促使T轉(zhuǎn)化為E2,使雌魚保持較高的E2水平。推測(cè)性類固醇激素合成相關(guān)基因及其受體基因的差異表達(dá)水平可能是導(dǎo)致雌雄個(gè)體生長(zhǎng)差異的原因之一,金錢魚的性類固醇激素合成相關(guān)基因及其受體基因可能參與調(diào)節(jié)雌、雄激素水平而影響雌、雄魚的生長(zhǎng)與生殖過程。本研究是首次對(duì)金錢魚性腺轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析,該結(jié)果為進(jìn)一步研究金錢魚的性別調(diào)控機(jī)制和分子特征提供了基礎(chǔ)的參考,并為水產(chǎn)養(yǎng)殖中金錢魚的性別控制和繁殖發(fā)育提供了一些基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支持。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖2-1轉(zhuǎn)錄組生物信息研究流程Fig.2-1 Transcriptome de novo bioinformatics research process2.1.2.4 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾測(cè)序平臺(tái)將測(cè)序結(jié)果圖像信號(hào)轉(zhuǎn)換成文字信號(hào)，并將其以 FASTQ 格式儲(chǔ)存起來作為原始數(shù)據(jù)（Raw reads）。過濾低質(zhì)量的 Reads 以保證后續(xù)分析結(jié)果的可靠性。過濾條件如下：1) 去掉包含接頭的序列；2) 去除 N 堿基比例超過 5%的序列；3) 去除包含 50%以上的堿基質(zhì)量值小于 10 的序列；最后，過濾后得到 Clean Read，并用于后續(xù)分析。2.1.2.5 De novo 拼接和組裝由于目前尚無金錢魚基因組信息，其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將進(jìn)行 De novo 組裝拼接，并以拼接得到的序列作為后續(xù)分析的參考序列。使用組裝軟件 Trinity 對(duì)去重復(fù)的 Cleanreads 進(jìn)行組裝。Trinty 組裝主要分為：①Inchworm；②Chrysalis；③Butterfly 3 個(gè)步

圖2-2組裝流程Fig. 2-2 Assembly procedure2.1.2.6 基因表達(dá)量計(jì)算本研究的基因表達(dá)水平計(jì)算方法采用目前較為常用的 FPKM ( Fragment Per Kibases per Million Reads )[149]，即每百萬 Reads 中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度fragment 數(shù)目。FPKM 同時(shí)考慮了基因長(zhǎng)度和對(duì)測(cè)序深度 Reads 計(jì)數(shù)的影響。其計(jì)算公式如下：其中，C 為唯一比對(duì)到基因的 fragment 數(shù)，N 為唯一比對(duì)到參考基因的總fragment 數(shù)，L 為基因的堿基數(shù)。2.1.2.7 Unigenes 功能注釋將得到的所有 unigenes 通過 Blast 比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋[150]，注釋數(shù)據(jù)庫(kù)包括：NCBI Nt (non-redundant nucleotide)/Nr (non-redundant protein)、基因本位(GeOntology, GO)、直系同源家族蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Clusters of Orthologous Groups, COG)、

廣東海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文表2-2 De novo組裝結(jié)果Table 2-2 De novo Assembly resultsAssembly NumberTotal number of unigenes 136561Min sequence length (bp) 200Max sequence length (bp) 22202Mean sequence length (bp) 1389.72N50 assembled transcripts length (bp) 3038N90 assembled transcripts length (bp) 496Assembled transcripts %G add %C 46.63

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本文編號(hào)：2802065