【摘要】：鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物弧菌病的重要病原菌,對我國大菱鲆、牙鲆、大西洋鮭、鰻鱺、鱸魚等經(jīng)濟魚種的危害性巨大。疫苗免疫是一種預(yù)防弧菌病的安全有效途徑。針對我國缺乏商業(yè)化魚用鰻弧菌疫苗的狀況,本論文基于鰻弧菌流行病學(xué)研究的前期結(jié)果,針對主要流行于我國的鰻弧菌O1、O2血清型菌株研制了二價滅活疫苗,研究了其免疫大菱鲆的抗體產(chǎn)生持續(xù)期和免疫保護持續(xù)期,分析了免疫劑量、抗體效價和免疫保護率的關(guān)系,研究結(jié)果補充了鰻弧菌二價滅活疫苗的中試實驗數(shù)據(jù);進一步研究了鰻弧菌O3血清型菌株的免疫原性和免疫保護率,研究結(jié)果為進一步開展鰻弧菌O3血清型疫苗的臨床前研究奠定了基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.鰻弧菌O1/O2血清型二價滅活疫苗的抗體產(chǎn)生持續(xù)期和免疫保護持續(xù)期。以O(shè)1血清型菌株VAM003和O2血清型菌株VAM007為抗原制備甲醛滅活二價疫苗,以不同免疫劑量對大菱鲆進行一次免疫和二次免疫,檢測了免疫大菱鲆的抗體產(chǎn)生和持續(xù)時間、免疫保護產(chǎn)生和持續(xù)時間,實驗持續(xù)時間為150 d。1.1一次免疫的抗體產(chǎn)生持續(xù)期和免疫保護持續(xù)期。以劑量107 cells/尾、108 cells/尾、109 cells/尾注射免疫大菱鲆一次,每組2500尾,在免疫后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d、60 d、90 d、120 d、150 d檢測免疫大菱鲆的血清抗體效價和疫苗的相對免疫保護率(Relative Percent Survival Rate,RPS)。血清抗體效價檢測結(jié)果顯示,在免疫后第7 d檢測到各免疫劑量組的特異血清抗體效價為1:20~1:100.8,說明鰻弧菌二價疫苗在免疫后第7 d可刺激大菱鲆產(chǎn)生免疫應(yīng)答。進一步分析結(jié)果顯示,各免疫劑量組的血清抗體效價在逐漸增加后緩慢下降,在免疫后21 d~30 d檢測到最高血清效價,按免疫劑量由低到高的順序,三個劑量組抗VAM003的最高效價均為1:320,抗VAM007的分別為1:1015.9、1:1280、1:320。免疫劑量越高,免疫魚維持較高血清抗體效價的時間越長,以血清效價大于1:20(有效抗體效價)為計,按免疫劑量由低到高的順序,抗VAM003的較高抗體產(chǎn)生時間分別為7 d~90 d、7 d~120d、7 d~150 d,三個劑量組抗VAM007的高水平抗體時間均為7 d~150 d。上述結(jié)果表明,鰻弧菌二價滅活疫苗以較高劑量(108 cells/尾,109 cells/尾)一次免疫大菱鲆,有效抗體產(chǎn)生持續(xù)期為4個月以上。RPS的結(jié)果顯示,在免疫后3 d,在不同免疫劑量的大菱鲆中均檢測到抗VAM007的RPS為26.7%~30%;在免疫后7 d,在不同免疫劑量的大菱鲆中檢測到抗VAM003的RPS為30%~60%,抗VAM007的RPS為5.9%~47.1%,這些結(jié)果表明鰻弧菌二價滅活疫苗一次免疫大菱鲆后3 d~7 d便提供免疫保護。免疫后14 d~90 d,在不同劑量的免疫魚均檢測到78.9%~100%的RPS,免疫劑量越高,免疫保護期越長,以RPS高于70%為有效免疫保護標(biāo)準(zhǔn),按免疫劑量由低到高的順序,大菱鲆抗VAM003的有效免疫保護持續(xù)時間為14 d~120 d、14 d~120 d、14 d~150 d,抗VAM007的為14 d~90 d、14 d~120d、14 d~150 d。上述結(jié)果表明,鰻弧菌二價滅活疫苗以107 cells/尾、108 cells/尾、109 cells/尾的劑量一次免疫大菱鲆,有效免疫保護期分別達90 d、120 d、150 d以上。血清抗體效價和RPS的相關(guān)性結(jié)果分析顯示,二者呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。按照免疫劑量從低到高的順序,由相關(guān)性公式得出,血清抗體效價分別在1:40~1:320、1:20~1:320、1:80~1:201.6時,抗鰻弧菌VAM003的有效免疫保護率RPS70%;血清抗體效價分別為1:201.6~1:1015.9、100.8~1280、1:63.5~1:320時,抗鰻弧菌VAM007的RPS70%。1.2二次免疫的抗體產(chǎn)生持續(xù)期和免疫保護持續(xù)期。一次免疫后60 d,對107 cells/尾和108 cells/尾劑量組的大菱鲆分別以同等劑量進行二次免疫,與一免進行血清效價和RPS比較。結(jié)果顯示,二次免疫后各組免疫魚的血清抗體效價比一免魚均有顯著提高,免疫劑量越高,效價越高,按免疫劑量由低到高的順序,抗VAM003血清效價分別為1:20~1:40、1:20~1:80(一免魚分別為0~1:40、1:7.4~1:40),抗VAM007血清效價分別為1:100.8~1:320、1:160~1:640(一免魚分別為1:63.5~1:253.9、1:40~1:320);免疫劑量越高,有效免疫保護時間越長,按免疫劑量由低到高的順序,抗VAM003的有效免疫保護時間分別超過至120 d和150 d,抗VAM007的均超過150d。二次免疫后,免疫大菱鲆血清抗體效價與RPS也呈一定的正相關(guān)關(guān)系,按照免疫劑量從低到高的順序,當(dāng)二次免疫血清抗體效價分別為1:20~1:40和1:20~1:80,抗鰻弧菌VAM003的有效免疫保護率RPS70%;當(dāng)血清抗體效價分別為1:100.8~1:253.9和1:160~1:640,抗鰻弧菌VAM007的有效RPS70%。綜合上述結(jié)果,以鰻弧菌二價疫苗一次免疫大菱鲆,免疫劑量為107 cells/尾時的抗體產(chǎn)生時間超過90 d、有效免疫保護期超過90 d;免疫劑量為108cells/尾時的抗體產(chǎn)生時間超過120 d、有效免疫保護期超過120 d;免疫劑量為109 cells/尾時的抗體產(chǎn)生時間超過150 d、有效免疫保護期超過150 d。以鰻弧菌二價疫苗二次免疫大菱鲆,免疫劑量為107 cells/尾時的抗體產(chǎn)生時間超過150 d、有效免疫保護期超過120 d,免疫劑量為108 cells/尾時的抗體產(chǎn)生時間超過150 d、有效免疫保護期超過150 d。2.鰻弧菌O3血清型菌株的免疫原性和免疫保護效果。對三株O3血清型鰻弧菌(SMP1、SMP3和SMP4)進行復(fù)壯,檢測了復(fù)壯菌株的半數(shù)致死量LD50分別為105.1CFU/m L(SMP1)、104.7 CFU/mL(SMP3)、105.4 CFU/m L(SMP4),制備了其甲醛滅活菌苗注射免疫牙鲆,分析了免疫魚的血清抗體效價和RPS。結(jié)果顯示,免疫后第7天可檢測到免疫魚血清的特異抗體效價,免疫后第4周的血清特異抗體效價為1:1280(SMP1)、1:640(SMP3)和1:905(SMP4),RPS為94.4%(SMP1)、100%(SMP3)和73.7%(SMP4)。結(jié)果表明三株O3血清型鰻弧菌菌株具有良好的免疫原性,SMP3最適合用作疫苗候選株。本研究為進一步開展鰻弧菌O3血清型疫苗的臨床前研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S942.5

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本文編號：2801670