發(fā)布時(shí)間：2020-08-19 08:39

【摘要】：血淋巴細(xì)胞是無(wú)脊椎動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)的核心和基礎(chǔ),是機(jī)體免疫防御的重要執(zhí)行者。不同亞型血淋巴細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、免疫功能及分子特征差異顯著。依據(jù)血淋巴細(xì)胞大小、核質(zhì)比,及顆粒度等形態(tài)特征,結(jié)合光學(xué)顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù),長(zhǎng)牡蠣血淋巴細(xì)胞被分為無(wú)粒細(xì)胞、半粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞。但三類亞型血淋巴細(xì)胞的具體分子特征尚不清楚。本研究以長(zhǎng)牡蠣為研究對(duì)象,在血淋巴細(xì)胞形態(tài)分類和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,篩選獲得顆粒細(xì)胞的分子標(biāo)記乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(命名為CgAATase)和轉(zhuǎn)錄因子SOX11(命名為CgSOX11);無(wú)粒細(xì)胞的分子標(biāo)記CD9 antigen(命名為CgCD9 antigen)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、Western Blot、免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)、亞細(xì)胞定位、單克隆抗體技術(shù)及免疫磁珠法等分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),對(duì)CgAATase、CgSOX11和Cg CD9 antigen的分子特征和特異性表達(dá)模式進(jìn)行了鑒定。主要取得以下結(jié)果:分析三類血淋巴細(xì)胞亞群的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)CgAATase在顆粒細(xì)胞中顯著性高表達(dá)。獲得CgAATase基因的核苷酸序列,CgAATase基因的編碼框含有1431個(gè)堿基(bp),編碼476個(gè)氨基酸,理論分子量為54.5kDa,結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)CgAATase含有經(jīng)典的AATase結(jié)構(gòu)域。CgAATase顯著高表達(dá)于血淋巴細(xì)胞,其表達(dá)水平為肝胰腺的37.31-fold(p0.05);在三類亞型血淋巴細(xì)胞中,CgAATase顯著高表達(dá)于顆粒細(xì)胞,表達(dá)水平分別為半粒細(xì)胞和無(wú)粒細(xì)胞的2.83-fold(p0.05)和8.50-fold(p0.05),在無(wú)粒細(xì)胞中表達(dá)量最低。燦爛弧菌(Vibrio splendidus)刺激可顯著誘導(dǎo)CgAATase mRNA的表達(dá)上調(diào),刺激后6小時(shí)CgAATase的mRNA表達(dá)水平達(dá)到最大值,為對(duì)照組的27.40倍(p0.05)。利用大腸桿菌(Escherichia coli)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得CgAATase的重組蛋白,利用雜交瘤技術(shù)制備CgAATase的單克隆抗體。ELISA結(jié)果顯示單克隆抗體1E10呈差異性表達(dá),在顆粒細(xì)胞中有較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào),陽(yáng)性值為1.078;在半粒細(xì)胞中陽(yáng)性值較低為0.229;而在無(wú)粒細(xì)胞中無(wú)陽(yáng)性值。發(fā)現(xiàn)CgAATase主要分布在顆粒細(xì)胞的細(xì)胞膜。結(jié)合免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀,單克隆抗體1E10可以對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行有效的分離,分離純度高達(dá)85.7±4.60%。發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)一周后,顆粒細(xì)胞仍具有較好的細(xì)胞活性,光學(xué)顯微鏡下可明顯觀察到細(xì)胞延伸出的絲狀偽足。上述結(jié)果表明CgAATase特異性分布在顆粒細(xì)胞表面,可作為顆粒細(xì)胞的分子標(biāo)記�？寺～@得了CgSOX11基因的編碼框區(qū)域,CgSOX11基因的編碼框含有1020bp,編碼339個(gè)氨基酸,理論分子量為38kDa。CgSOX11含有保守的HMG盒子結(jié)構(gòu)域。CgSOX11的HMG盒子區(qū)域及C-末端與脊椎動(dòng)物和模式物種的相似度高達(dá)80%。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明長(zhǎng)牡蠣CgSOX11與蝦夷扇貝MySOX11聚為一支,歸為無(wú)脊椎動(dòng)物類。CgSOX11mRNA在血淋巴細(xì)胞和鰓中表達(dá)量較高,分別為唇瓣的2.78-fold(p0.05)和1.95-fold(p0.05);在三類亞型血淋巴細(xì)胞中,CgSOX11mRNA在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為無(wú)粒細(xì)胞和半粒細(xì)胞19.14-fold(p0.05)和17.26-fold(p0.05)。V.splendidus刺激后CgSOX11 mRNA表達(dá)水平顯著上升,在刺激后3小時(shí)達(dá)到最高值,為對(duì)照組的8.03-fold(p0.05)。利用E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)獲得CgSOX11重組蛋白,免疫Balb/C小鼠獲得多克隆抗體。通過(guò)Western Blot分析在血淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到明顯的2條顯色帶(約38kDa和50kDa)。其中38kDa處的蛋白與預(yù)期目的蛋白大小一致。血淋巴細(xì)胞與SUMO1,2,3單克隆抗體孵育發(fā)現(xiàn),Western Blot和IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到50kDa的特異性顯色帶,推測(cè)CgSOX11在體內(nèi)可能發(fā)生SUMOylation修飾。CgSOX11和SUMO蛋白主要分布于血淋巴細(xì)胞細(xì)胞核上。結(jié)合免疫磁珠法和流式細(xì)胞術(shù),CgSOX11多克隆抗體可以對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行有效分離,采用負(fù)向分選的方法,可以看到顆粒細(xì)胞明顯的缺失,分離純度為81.2%。上述結(jié)果表明CgSOX11可以作為顆粒細(xì)胞的分子標(biāo)記。分析長(zhǎng)牡蠣基因組序列信息,得知CgCD9 antigen含有693bp,編碼230個(gè)氨基酸,理論分子量為25kDa,發(fā)現(xiàn)CgCD9 antigen含有經(jīng)典的四次跨膜(Tetraspannin)結(jié)構(gòu)域。將體外合成的CgCD9 antigen大環(huán)胞外段的11aa作為免疫原免疫Balb/C小鼠,利用雜交瘤技術(shù)制備CgCD9 antigen單克隆抗體。ELISA實(shí)驗(yàn)表明單克隆抗體3D8與無(wú)粒細(xì)胞具有較高的特異性,特異性值為1.596(P/N2.1),與半粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞具有較低或無(wú)特異性,單克隆抗體3D8為CgCD9 antigen的特異性抗體。亞細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明CgCD9 antigen主要分布于無(wú)粒細(xì)胞的細(xì)胞膜。結(jié)合免疫磁珠法和流式細(xì)胞術(shù),單克隆抗體3D8可以對(duì)無(wú)粒細(xì)胞進(jìn)行高純度分離,純度為86.9±2.90%。對(duì)分離出的無(wú)粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),培養(yǎng)一周后,無(wú)粒細(xì)胞仍具有較好的細(xì)胞活性。上述結(jié)果表明CgCD9 antigen可以作為無(wú)粒細(xì)胞的分子標(biāo)記物,為識(shí)別無(wú)粒細(xì)胞提供了分子基礎(chǔ)。綜上所述,CgAATase和CgSOX11在顆粒細(xì)胞中特異性高表達(dá),CgAATase主要分布于顆粒細(xì)胞的細(xì)胞膜上,成功獲得CgAATase單克隆抗體1E10,分離出高純度且具有活性的顆粒細(xì)胞;CgSOX11主要分布于顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核中,可能通過(guò)SUMOylation行使免疫功能,獲得其多克隆抗體,分離出高純度的顆粒細(xì)胞;CgCD9 antigen在無(wú)粒細(xì)胞中特異性高表達(dá),且位于無(wú)粒細(xì)胞的細(xì)胞膜上,成功獲得CgCD9 antigen單克隆抗體1E10,且分離出高純度且具有活性的無(wú)粒細(xì)胞。這些研究結(jié)果在細(xì)胞和分子水平豐富了當(dāng)前對(duì)長(zhǎng)牡蠣顆粒細(xì)胞和無(wú)粒細(xì)胞的認(rèn)知和鑒定,為研究血淋巴細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育、免疫功能及調(diào)控機(jī)制提供了良好的借鑒。
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

記 CgAATase 的鑒定及顆粒細(xì)胞的分離Tase 的分子特征顆粒細(xì)胞的特異性基因，在顆粒細(xì)胞上調(diào)表達(dá)的基因中，對(duì)相為：在顆粒細(xì)胞中顯著性高表達(dá)，且位于細(xì)胞膜，為后續(xù)活性胞的體外培養(yǎng)提供條件。篩選發(fā)現(xiàn) CgAATase 基因在顆粒細(xì)胞粒細(xì)胞的 8.26 倍（p < 0.05）和半粒細(xì)胞的 2.14 倍（p < 0.05）ank 數(shù)據(jù)庫(kù)（Accession No. XM_020065799）中下載得到 CgA并據(jù)此推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列和蛋白序列。CgAATase 基因，編碼一條由 476 個(gè)氨基酸組成的多肽，其理論分子量為 54.5kMART 預(yù)測(cè)顯示 CgAATase 含有一個(gè)經(jīng)典 AATase 的結(jié)構(gòu)域，個(gè)氨基酸處（圖 3-1，圖 3-2）。

28圖 3-2 長(zhǎng)牡蠣 CgAATase 的氨基酸序列，灰色部分代表結(jié)構(gòu)域Fig 3-2 The amino acid sequence of CgAATase, The AATase domain is shadowed.AATase 的表達(dá)特征熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 對(duì) CgAATase 的組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)了 CgAA、鰓、唇瓣、外套膜、性腺、神經(jīng)節(jié)、肌肉柱和肝胰腺，及在顆粒細(xì)胞細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CgAATase 在血淋巴細(xì)胞中顯著性高表

1.13-fold(p>0.05)和 0.35-fold(p>0.05)，無(wú)差異性表達(dá) (圖3-3)。圖 3-3 長(zhǎng)牡蠣 CgAATase 轉(zhuǎn)錄水平的組織分布Fig 3-3 Tissue distribution of CgAATase mRNA實(shí)驗(yàn)室前期研究，利用 Percoll 密度梯度離心，將血淋巴細(xì)胞在 Percoll 分離液（30%/55%）中被分為三層，無(wú)粒細(xì)胞主要位于上層，半粒細(xì)胞主要位于中間層，顆粒細(xì)胞則大部分位于底層，分別占總血淋巴細(xì)胞的 32.27±2.61%、40.01±1.92%和 27.63±1.60%[17]。本研究利用 RT-PCR 對(duì) CgAATase 在三類血淋巴細(xì)胞亞群中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，CgAATase 在顆粒細(xì)胞中表達(dá)量最高，分別是半粒細(xì)胞和無(wú)粒細(xì)胞表達(dá)量的 2.83-fold 和 8.50-fold (p < 0.05)，在無(wú)粒細(xì)胞中表達(dá)量最低，與單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果一致（圖 3-4）。

【參考文獻(xiàn)】

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1 李冠楠;夏雪娟;隆耀航;李姣蓉;武婧潔;朱勇;;抗菌肽的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2014年01期

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本文編號(hào)：2796867