【摘要】：絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinases, MAPKs)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一。p38MAPKs是MAPK家族中的重要成員,被認(rèn)為是細(xì)胞眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中轉(zhuǎn)站。MAPK的激活需要雙位點(diǎn)磷酸化,p38亞家族的所有成員都具有“T-G-Y”雙位點(diǎn)磷酸化模塊。通過上游的MKK3和MKK6磷酸化TGY模塊而激活p38蛋白。磷酸化的P38再激活一些轉(zhuǎn)錄因子和其他的蛋白酶后可導(dǎo)致許多生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生,參與細(xì)胞存活、分化和凋亡等過程,在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中也有重要作用。文昌魚是脊索動(dòng)物中的基底生物,是研究無脊椎動(dòng)物過渡到脊椎動(dòng)物的模式動(dòng)物,文昌魚在生物進(jìn)化中的特殊地位,能夠?yàn)檠芯考棺祫?dòng)物p38MAPKs信號(hào)通路以及免疫系統(tǒng)的進(jìn)化提供關(guān)鍵的證據(jù)。本論文以白氏文昌魚p38為研究對(duì)象,通過基因克隆、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡、生物信息分析等技術(shù)手段得到以下的研究結(jié)果：(1)本研究采用RACE技術(shù)克隆了白氏文昌魚p38基因全長(zhǎng),命名為Amphip38。其cDNA序列全長(zhǎng)為1329bp,其中5’UTR為88bp,3'UTR為131bp,ORF長(zhǎng)為1110bp。Amphip38的ORF編碼了369個(gè)氨基酸,包含一個(gè)高度保守的STK(絲氨酸／蘇氨酸激酶)結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)蛋白分子量為42 kDa,等電點(diǎn)為5.52。(2) 通過蛋白序列的同源性分析,Amphip38與其他物種的p38蛋白氨基酸序列有較高的相似性(80.5%-84%)和一致性(67.2%-72.5%)。Amphip38與脊椎動(dòng)物鱸魚(Dicentrarchus labrax)的Mapkl4有最高一致性為72.5%。由此可以確認(rèn)Amphip38是脊椎動(dòng)物p38的同源基因。(3) 同源性分析可見p38蛋白在動(dòng)物中較保守,通過p38蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列的分析,在p38蛋白中STK結(jié)構(gòu)域是非常保守的。TGY模塊、CD模塊,ATP結(jié)合環(huán)(ATP binding loop)、ED位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)(substrate binding site),這些保守的位點(diǎn)對(duì)p38蛋白行使功能有重要的作用。我們進(jìn)一步預(yù)測(cè)了p38蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Amphip38與其他物種的p38蛋白結(jié)構(gòu)非常相似,呈馬鞍形狀,蛋白表面有一個(gè)重要的凹槽,凹槽中有p38蛋白重要的結(jié)構(gòu)-“磷酸化唇”,TGY motif就在這個(gè)區(qū)域,是p38的激活位點(diǎn)。Docking site, CD site, ED site在Amphip38蛋白空間結(jié)構(gòu)中都位于蛋白三維結(jié)構(gòu)表面,這可能與p38蛋白與底物的結(jié)合有關(guān)。(4) 將白氏文昌魚Amphip38蛋白和其他物種p38蛋白進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,結(jié)果表明：白氏文昌魚Amphip38基因的進(jìn)化地位位于無脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物之間,與脊椎動(dòng)物更為親近。另外,p38家族在從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因重復(fù)或分化,導(dǎo)致生成了四個(gè)亞型(p38α、p38β、 p38γ和p38δ)。(5)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Amphip38在五個(gè)組織中都廣泛表達(dá),但表達(dá)量有差異：Amphip38在脊索與肌肉中表達(dá)量豐富,在肝盲囊表達(dá)量適中,在腸與鰓中較低。在脊索和肌肉中的高表達(dá)量可能與p38的組織特異性功能有關(guān),在肌肉和脊索中可能主要參與細(xì)胞的增值、分化的調(diào)控,由于肝盲囊是脊椎動(dòng)物肝臟的前體組織,在肝盲囊中較高的表達(dá)可能與文昌魚的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。(6) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LPS刺激后在不同時(shí)間點(diǎn)(2 h,4 h,6 h,8 h,12 h,24 h)文昌魚Amphip38基因的表達(dá)量變化,在4h和6h出現(xiàn)了顯著升高,并且在6h上升到最高。此變化初步證明了白氏文昌魚Amphip38基因參與先天免疫應(yīng)答。(7) 利用western blot技術(shù)檢測(cè)LPS注射后0.5h和lh,p38蛋白的磷酸化水平明顯增多,而在注射后的3h和6h下降。在蛋白水平上進(jìn)一步證實(shí)了Amphip38蛋白與哺乳動(dòng)物p38蛋白有相同的功能機(jī)制,通過磷酸化激活參與文昌魚的先天免疫應(yīng)答�？傊�,我們首次克隆了Amphip38基因并研究分析了Amphip38蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。我們的結(jié)果表明,Amphip38在白氏文昌魚中參與先天免疫應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Amphip38基因是脊椎動(dòng)物的祖先基因。我們當(dāng)前的研究可為先天免疫機(jī)制的研究以及p38家族的進(jìn)化提供有價(jià)值的信息。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖１．１文昌魚的解剖圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏ打邋ｏｆ邋ａｍｐｈｉｏｘｕｓ逡逑

圖１．２邋ＭＡＰＫ激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋ＭＡＲＫ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑１．２．３邋ｐ３邋８研究近況逡逑相比于其他ＭＡＰＫｓ，邋ｐ３８ａ沒有檢測(cè)到核定位信號(hào)。在沒有刺激的細(xì)胞中，逡逑在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都可Ｗ檢測(cè)到ｐ３８ａ［ｉ６］。一些證據(jù)表明，激活后，ｐ３８ａ從細(xì)逡逑胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核，但是，送樣通過刺激的亞細(xì)胞定位是有爭(zhēng)議的，也有證據(jù)表明，逡逑在響應(yīng)特定的刺激中ｐ３８ａ優(yōu)先在細(xì)胞質(zhì)積累口２］。這種差異可能是由于不同的逡逑ｐ３８ａ分子位于不同亞細(xì)胞的隔間及綁定不同的合作伙伴，例如易位激活的逡逑ｐ３８ａ從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核歸因于在核出口與底物ＭＫ２z1合［氣最近的一項(xiàng)研逡逑究認(rèn)為ｐ３８ａ核易位可能與Ｇ２邋／邋Ｍ細(xì)胞周期調(diào)控的逮捕和促進(jìn)ＤＮＡ修復(fù)有關(guān)。逡逑因?yàn)榧せ畹模穑常福嵋孜坏郊?xì)胞核誘導(dǎo)了邋ＤＮＡ雙螺旋的削弱，但沒有其他刺激Ｐ２］。逡逑這樣的易位不需要ｐ３８ａ的催化活性，由Ｔｈｒｌ８０和Ｔｙｒｌ８２x鎪嶧緯傻墓瓜蟮膩義媳浠�，因为７w常稿澹岬膞鎪嶧嵌裕模危了鶘說姆從�，而不蕷J攵云淥碳�，促进辶x蝦嘶郟乇鶚牽模危了鶘艘鸕�，７w常福岷艘孜灰彩嗆俠淼�，因此选择性核运辶x

本文編號(hào)：2796846