【摘要】：細(xì)菌效應(yīng)物是細(xì)菌與宿主相互作用時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主中的一類蛋白,大多數(shù)為毒力蛋白,能夠通過干擾宿主的膜運(yùn)輸、MAPK信號(hào)通路、泛素化途徑等生理過程使宿主致病。本文研究的遲緩愛德華氏菌是一種重要的海洋病原菌,但是目前關(guān)于其效應(yīng)物的報(bào)道甚少。在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn),遲緩愛德華氏菌在感染小鼠巨噬細(xì)胞后,細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄譜發(fā)生了顯著變化,這暗示著差異轉(zhuǎn)錄基因可能是作為毒力效應(yīng)因子在感染過程中發(fā)揮了重要作用。本課題以這些感染過程中顯著變化的120個(gè)基因作為潛在的細(xì)菌毒力效應(yīng)因子,利用不同的方法進(jìn)行了細(xì)菌效應(yīng)物的篩選、鑒定以及功能研究。首先,通過構(gòu)建效應(yīng)物與p-內(nèi)酰胺酶融合表達(dá)菌株,利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移法,我們進(jìn)行了初步篩選與鑒定,得到一系列能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞的候選效應(yīng)物；其次,通過免疫熒光和免疫印跡法進(jìn)一步鑒定了這些候選效應(yīng)物的轉(zhuǎn)運(yùn)情況,最終得到ETAE_0247、ETAE_0275、ETAE_0490、ETAE_1303、ETAE_1640、ETAE_2080、 ETAE_2136、ETAE_2188和ETAE_2399這9個(gè)新的細(xì)菌效應(yīng)物；然后,考察了這些效應(yīng)物的胞外分泌情況,發(fā)現(xiàn)存在全部分泌、部分分泌和不分泌的特征,從而揭示了效應(yīng)物分泌機(jī)制的多樣性以及分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)的非耦聯(lián)性；再者,從理化性質(zhì)與功能結(jié)構(gòu)域等多角度對(duì)效應(yīng)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)部分效應(yīng)物含有信號(hào)肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域,暗示這些效應(yīng)物在宿主中可能具有特殊的定位與功能；最后重點(diǎn)研究了效應(yīng)物EseG的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位特征。通過細(xì)胞松弛素D抑制和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)首次證明了效應(yīng)物EseG的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴細(xì)菌內(nèi)化,即只有胞內(nèi)的細(xì)菌才能將EseG轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞中；通過組分分離和免疫熒光實(shí)驗(yàn)首次證明了EseG在宿主細(xì)胞中特異性定位在吞噬泡膜上,這種特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位方式表明EseG可能在細(xì)菌攝入后發(fā)揮功能并且可能與小泡膜的形成有關(guān)。本課題的研究鑒定獲得了9個(gè)新的遲緩愛德華氏菌效應(yīng)物,并闡明了EseG的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位特征。上述工作為進(jìn)一步解析這些效應(yīng)物的功能及遲緩愛德華氏菌的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S941.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 Khavong Pha;Lorena Navarro;;Yersinia type Ⅲ effectors perturb host innate immune responses[J];World Journal of Biological Chemistry;2016年01期

本文編號(hào)：2794863