【摘要】：細菌效應物是細菌與宿主相互作用時轉(zhuǎn)運到宿主中的一類蛋白,大多數(shù)為毒力蛋白,能夠通過干擾宿主的膜運輸、MAPK信號通路、泛素化途徑等生理過程使宿主致病。本文研究的遲緩愛德華氏菌是一種重要的海洋病原菌,但是目前關(guān)于其效應物的報道甚少。在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn),遲緩愛德華氏菌在感染小鼠巨噬細胞后,細菌基因轉(zhuǎn)錄譜發(fā)生了顯著變化,這暗示著差異轉(zhuǎn)錄基因可能是作為毒力效應因子在感染過程中發(fā)揮了重要作用。本課題以這些感染過程中顯著變化的120個基因作為潛在的細菌毒力效應因子,利用不同的方法進行了細菌效應物的篩選、鑒定以及功能研究。首先,通過構(gòu)建效應物與p-內(nèi)酰胺酶融合表達菌株,利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移法,我們進行了初步篩選與鑒定,得到一系列能夠轉(zhuǎn)運至宿主細胞的候選效應物；其次,通過免疫熒光和免疫印跡法進一步鑒定了這些候選效應物的轉(zhuǎn)運情況,最終得到ETAE_0247、ETAE_0275、ETAE_0490、ETAE_1303、ETAE_1640、ETAE_2080、 ETAE_2136、ETAE_2188和ETAE_2399這9個新的細菌效應物；然后,考察了這些效應物的胞外分泌情況,發(fā)現(xiàn)存在全部分泌、部分分泌和不分泌的特征,從而揭示了效應物分泌機制的多樣性以及分泌和轉(zhuǎn)運的非耦聯(lián)性；再者,從理化性質(zhì)與功能結(jié)構(gòu)域等多角度對效應蛋白進行了生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)部分效應物含有信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域,暗示這些效應物在宿主中可能具有特殊的定位與功能；最后重點研究了效應物EseG的轉(zhuǎn)運與定位特征。通過細胞松弛素D抑制和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運實驗首次證明了效應物EseG的轉(zhuǎn)運依賴細菌內(nèi)化,即只有胞內(nèi)的細菌才能將EseG轉(zhuǎn)運至宿主細胞中；通過組分分離和免疫熒光實驗首次證明了EseG在宿主細胞中特異性定位在吞噬泡膜上,這種特異性的轉(zhuǎn)運與定位方式表明EseG可能在細菌攝入后發(fā)揮功能并且可能與小泡膜的形成有關(guān)。本課題的研究鑒定獲得了9個新的遲緩愛德華氏菌效應物,并闡明了EseG的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和定位特征。上述工作為進一步解析這些效應物的功能及遲緩愛德華氏菌的致病機理奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S941.4

【參考文獻】

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1 Khavong Pha;Lorena Navarro;;Yersinia type Ⅲ effectors perturb host innate immune responses[J];World Journal of Biological Chemistry;2016年01期

本文編號：2794863