【摘要】：本研究論文由兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的部分組成：第一部分,斑馬魚消化器官突變體的正向遺傳篩選；第二部分,斑馬魚Ubel蛋白的原核表達(dá)、純化及抗體生產(chǎn)。故在此分別闡述：斑馬魚為小型亞熱帶淡水魚類。長(zhǎng)期以來(lái),斑馬魚因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),成為研究脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的完美模型。斑馬魚易于飼養(yǎng),并在三個(gè)月左右達(dá)到性成熟。雌魚每周可產(chǎn)數(shù)百粒卵,胚胎透明且在母體外發(fā)育,非常適合作大規(guī)模遺傳篩選。腸道和肝臟都發(fā)育自內(nèi)胚層,然而,我們至今仍不清楚,這兩種器官的發(fā)育分子機(jī)制有怎樣的相似性和不同點(diǎn)。針對(duì)此問(wèn)題,我們通過(guò)無(wú)基因差別的正向遺傳篩選,獲得肝臟和腸道缺陷的突變體,以探究對(duì)這兩大器官發(fā)育有影響的突變基因。ENU因其高效和無(wú)位點(diǎn)偏好性的特點(diǎn)被用于本研究的誘變劑。收集3.5dpf斑馬魚胚胎用于全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn),探針采用腸道特異標(biāo)記ifabp和肝臟特異標(biāo)記lfabp,根據(jù)表型結(jié)果統(tǒng)計(jì)和孟德爾遺傳定律確定其父母是否為攜帶隱性突變的雜合突變體。篩選首先在F2代進(jìn)行,具有一般性缺陷的疑似突變體被我們丟棄。為了排除因高突變背景造成的非遺傳性突變表型,我們將F2的疑似突變體雜合子與野生型進(jìn)行雜交,并在F3代中再次進(jìn)行篩選。在對(duì)78個(gè)突變基因組進(jìn)行篩選后,我們得到了源于22個(gè)F2家族的37個(gè)F3突變體。對(duì)這37個(gè)F3突變體進(jìn)行分型,發(fā)現(xiàn)其中31個(gè)突變體的肝臟和腸道都有缺陷,4個(gè)“腸道特異性突變體”和2個(gè)“肝臟特異性突變體”分別表現(xiàn)出腸道或肝臟更加嚴(yán)重的缺陷表型。這些數(shù)據(jù)表明,斑馬魚中調(diào)控肝臟和腸道發(fā)育的因子大都是相似或相同的。對(duì)突變體的進(jìn)一步研究,有望讓我們對(duì)斑馬魚及其它脊椎動(dòng)物消化器官發(fā)育的分子機(jī)制有更深的理解。泛素化修飾是ATP依賴性的過(guò)程,需要E1(泛素激活酶)、E2(泛素轉(zhuǎn)移酶)、E3(泛素連接酶)三種酶共同完成。通常,單泛素化修飾改變底物蛋白的亞細(xì)胞定位或募集,而K48多泛素化修飾導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的降解,26S蛋白降解復(fù)合體識(shí)別多泛素化的底物,并將其去折疊、降解成小肽段。泛素化修飾通路對(duì)于真核細(xì)胞中大多數(shù)短周期性蛋白的降解是必需的,而且從酵母到哺乳動(dòng)物都是保守的。泛素化修飾不僅對(duì)細(xì)胞的自穩(wěn)態(tài)必不可少,而且對(duì)于許多人類疾病具有重大影響。由于泛素依賴性蛋白降解常常被用于調(diào)控細(xì)胞分裂周期和細(xì)胞生長(zhǎng),研究者們發(fā)現(xiàn)蛋白降解抑制因子可能被用于癌癥和白血病等疾病的治療。Ube1是泛素化修飾中起主要作用的E1,對(duì)于泛素鏈第一步反應(yīng)必不可少,對(duì)細(xì)胞分裂、分化和機(jī)體穩(wěn)態(tài)等重要途徑具有十分重要的意義�；赨be1的結(jié)構(gòu)和生化研究,以及對(duì)泛素通路相關(guān)酶和蛋白的研究,都離不開高純度的Ube1蛋白。首先,我們將斑馬魚ube1基因全長(zhǎng)CDS序列克隆進(jìn)pSUMO(pET28a-SUMO)表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入E.coli BL21表達(dá)菌株,采用親和層析的方式純化Ube1蛋白。然而,考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示,純化得到的蛋白樣品中含有較高比例的雜蛋白。Western blot結(jié)果顯示,其中雜蛋白大都為全長(zhǎng)Ube1蛋白斷裂的片段,在原核表達(dá)之初即存在,從而影響了后續(xù)的蛋白純化。隨后,我們改變策略,將Ube1蛋白碳端105個(gè)aa的編碼核酸序列克隆進(jìn)pET28a表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入E.coli BL21表達(dá)菌株,采用親和層析的方式純化Ubel C'terminal短肽,結(jié)果得到了純度較高的蛋白樣品。以該蛋白樣品為抗原、雄兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,生產(chǎn)Ube1抗體。Western blot結(jié)果顯示,生產(chǎn)的Ube1抗體工作好,且效價(jià)高。采用抗原抗體親和純化的方法,對(duì)上述Ube1抗體進(jìn)行純化,使得抗體特異性有了明顯提高,且抗體回收率在25%以上。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

稱為ｆｏｕｎｄｅｒ，與野生型雜交以產(chǎn)生Ｆ１代。Ｆ２家族由來(lái)自不同ｆｏｕｎｄｅｒ的Ｆ１魚交配產(chǎn)生，而逡逑非通常的ｎ與野生型雜交（因ＥＮＵ誘變是隨機(jī)的，一條Ｆ１上發(fā)生的某一特定突變，很難逡逑在來(lái)自另一邋ｆｏｕｎｄｅｒ的Ｆ１發(fā)生，故二者可互為野生型，從而提高蹄選效率）（圖２．１）。此過(guò)逡逑程由西南大學(xué)羅凌飛教授實(shí)驗(yàn)室完成。逡逑（２）肝臟和腸道突變體的篩選（Ｆ２）逡逑我們將來(lái)自同一邋Ｆ２家族的斑馬魚隨機(jī)交配以獲�。疲澈蟠�，在３．５ｄｐｆ時(shí)收集約４０顆胚逡逑胎，用于做原位雜交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)孟德爾分離定律，若Ｆ３后代中有２５％左右表現(xiàn)出相同的缺逡逑陷，則其Ｆ２父母可被認(rèn)定為攜帶隱性突變的雜合突變體（圖２．１）邋？逡逑（３）突變體的傳代和再蹄選（Ｆ３）逡逑將Ｆ２突變體與野生型雜交傳代，產(chǎn)生的后代稱為Ｆ３。與Ｆ２代篩選類似，Ｆ４胚胎被用逡逑于確定Ｆ３雜合突變體（圖２．１）。逡逑（４）互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)與突變體表型的分類逡逑若來(lái)自同一邋Ｆ２家族的ｎ突變體具有相似的表型，則需要將兩者相互交配進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)逡逑驗(yàn)，如果后代產(chǎn)生２５％的突變表型，則可認(rèn)為兩者為相同突變體。最終確定的Ｆ３突變體，逡逑將會(huì)依據(jù)其表型特征被分為幾種不同的類別。逡逑１１逡逑

Ｆｉｇ．邋３．１邋Ｂｒｉｅｆ邋ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐＳＵＭＯ邋ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑ｐＳＵＭＯ載體以ｐＥＴ２８ａ為原型，在Ｍｅ／和及冊(cè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)間插入編碼ＳＵＭＯ逡逑蛋白（Ｓｎｉｔ３ｐ，ＮＰ＿０１０７９８）的基因。在ｐＳＵＭＯ載體中，圖３．１所示蛋白表達(dá)區(qū)以Ｔ７邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ逡逑啟動(dòng)表達(dá)。若以ｐＳＵＭＯ為原核表達(dá)載體，目的基因序列可插入Ｓａｃｌ，邋Ｓａｉｌ，邋Ｈｉｎｄｌｌｌ，逡逑Ｎｏｔｌ．邋ＡＴｗ廠多克隆位點(diǎn)之間。表達(dá)得到的目的蛋白Ｎ’端會(huì)帶有６Ｈｉｓ標(biāo)簽和ＳＵＭＯ融合蛋逡逑白，導(dǎo)致其分子量增加１３邋ｋＤａ左右。ＳＵＭＯ蛋白的存在能夠增加融合蛋白的表達(dá)量，并增逡逑加蛋白的可溶性，而且使用ＳＵＭＯ蛋白酶能夠去除融合的ＳＵＭＯ蛋白。逡逑在本研究中，將斑馬魚ｕｂｅｌ基因的全長(zhǎng)ＣＤＳ插入Ｓａｉｌ酶切位點(diǎn)，并保證ＯＲＦ對(duì)框翻逡逑譯。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，將得到６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－Ｕｂｅｌ融合蛋白。經(jīng)過(guò)Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡ邋Ｓｔａｒ）軟件逡逑ＥｄｉｔＳｅｑ組件的運(yùn)算，發(fā)現(xiàn)融合蛋白含有１１８７個(gè)氛基酸（ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ，邋ａａ），分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ逡逑Ｗｅｉｇｈｔ，邋ＭＷ）約為邋１３３ｋＤａ，等電點(diǎn)（Ｉｓｏｌｅｃｔｒｉｃ邋Ｐｏｉｎｔ，ＩＰ）約為邋５

逡逑圖３．８所示為１Ｌ邋Ｅ．ｃｏｌｉ邋ＢＬ２１菌液誘導(dǎo)表達(dá)６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－Ｕｂｅｌ蛋白后，經(jīng)親和層析純化逡逑（ＵＬＰ１酶切洗脫）的結(jié)果。與圖３．４相比，其蛋白得率要小得多，且非目的蛋白依然含量逡逑較大。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｋ）ｔ結(jié)果顯示，圖３．８中出現(xiàn)的非目的蛋白并非雜蛋白，而是全長(zhǎng)Ｕｂｅｌ蛋白逡逑斷裂的部分（圖３．９，其中，一抗為生物公司生產(chǎn)ａｎｔｉ－Ｕｂｅｌ抗體，二抗為Ｓａｎｔａ邋Ｃｒｕｚ逡逑Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司的ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ抗體）。該結(jié)果與圖３．６和圖３．７是一致的，說(shuō)明在Ｕｂｅ丨蛋逡逑白誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，即部分被降解成小片段。因無(wú)法得到純度較高的Ｕｂｅｌ蛋白，故體外泛逡逑素化實(shí)驗(yàn)只能暫時(shí)摘置。逡逑／、＜／邋ｙ邋、－逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋妒、。、／邋＝／《義逡逑２５０逡逑１５０灥滛邐碰幽！免邐ａ－Ｕｂｃｌ逡逑１００邋ｍｍ逡逑Ｊ邋抽．＊逡逑７５邋（ＨＩ邐W逡逑．ｎｍ邋－鞭：逡逑ｍｍ－逡逑圖３．９親和層析純化Ｕｂｅｌ蛋白（ＵＬＰＩＳＩ切洗脫）的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂ丨ｏｔ檢測(cè)逡逑Ｆｉｇ．邋３．９邋Ｗｅｓｔｅｎ邋ｂｌｏｔ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｕｂｅｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ逡逑ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＵＬＰｌ邋ｐｒｏｔｅａｓｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｅｌｕｓｉｏｎ）逡逑３．２．３邋ｕｂｅｌ基因部分表達(dá)序列的原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建逡逑鑒于體外泛素化研究暫時(shí)無(wú)法進(jìn)行，而本實(shí)驗(yàn)室另一研工作亟需Ｕｂｅｌ抗體（之前公司逡逑所合抗體大樣不工作，小樣已用完），故我們打算純化Ｕｂｅｌ蛋白用于生產(chǎn)抗體。而用于生逡逑產(chǎn)抗體的抗原

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;The role of mesodermal signals during liver organogenesis in zebrafish[J];Science China(Life Sciences);2010年04期

2 ;Liver development in zebrafish (Danio rerio)[J];遺傳學(xué)報(bào);2009年06期

本文編號(hào)：2794809