【摘要】：半滑舌鰨和星斑川鰈是我國北方沿海區(qū)市場價(jià)值較高的鲆鰈魚類。半滑舌鰨是屬于黃渤海特種魚類,也是近10年來開發(fā)的工廠化養(yǎng)殖名貴魚類。星斑川鰈主要分布于北太平洋,在我國黃海的北部深水處才能找到它的蹤跡,其野生資源量非常少。它們與大菱鲆、牙鲆一起已成為我國北方海水魚類養(yǎng)殖業(yè)的主導(dǎo)。本論文從分子遺傳育種的實(shí)際需求出發(fā),主要進(jìn)行了以下三個(gè)方面的內(nèi)容:首先對半滑舌鰨真、偽雄魚母系半同胞家系進(jìn)行了遺傳多樣性分析;然后對星斑川鰈進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)并對搜索出的微衛(wèi)星序列進(jìn)行了特征分析;并對星斑川鰈進(jìn)行了性別特異微衛(wèi)星標(biāo)記篩選。主要有以下研究結(jié)果:1.半滑舌鰨真、偽雄魚半同胞家系的遺傳多樣性分析半滑舌鰨養(yǎng)殖群體中存在真雄魚(ZZ)和偽雄魚(ZW)現(xiàn)象,其遺傳特征進(jìn)行研究,對于半滑舌鰨育種及優(yōu)良苗種培育具有重要的意義。本研究以半滑舌鰨真、偽雄魚群體及母系半同胞家系為研究對象,利用半滑舌鰨22對多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記,對兩組半滑舌鰨真、偽雄魚半同胞家系群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示:篩選出的22對引物擴(kuò)增產(chǎn)物均具有多態(tài)性,4個(gè)半同胞家系群體中共檢測到232個(gè)等位基因,群體平均等位基因數(shù)Na均大于平均有效等位基因數(shù)Ne;平均觀測雜合度Ho均小于平均期望雜合度He;平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.4566、0.4254、0.5069、0.4795。22個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在4個(gè)半同胞家系群體中分別有3、3、4和5個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。4個(gè)半同胞家系群體間的Nei's遺傳距離為0.2101~0.5840,遺傳相似性系數(shù)為0.5577~0.8105。本文研究表明:半滑舌鰨真、偽雄魚半同胞家系間的遺傳相似系數(shù)較高、遺傳距離較小,遺傳多樣性指標(biāo)相近。2.星斑川鰈微衛(wèi)星序列的開發(fā)及其相關(guān)特征分析本研究利用RAD-seq技術(shù)對星斑川鰈的雌、雄基因池進(jìn)行了微衛(wèi)星序列的搜索,在長度為89810018 bp的星斑川鰈DNA測序序列中,共找到48185個(gè)微衛(wèi)星序列,其中完全型微衛(wèi)星序列共有36804個(gè),其序列總累積長度占所測序長度的0.82%。檢測出的微衛(wèi)星序列中,有單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基6種重復(fù)單元類型,在完全型微衛(wèi)星序列中,二堿基重復(fù)類型的微衛(wèi)星序列數(shù)最多,占序列總數(shù)的72.79%,其次是三堿基重復(fù)類型,占序列總數(shù)的10.80%。AC是二堿基重復(fù)類型中微衛(wèi)星序列數(shù)最多的重復(fù)拷貝類別,占二堿基重復(fù)類型序列總數(shù)的76.56%。本論文對星斑川鰈微衛(wèi)星序列的不同重復(fù)單元與相應(yīng)平均拷貝數(shù)進(jìn)行了相關(guān)分析,結(jié)果顯示,微衛(wèi)星序列重復(fù)單元的長度與平均拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.789),說明隨著微衛(wèi)星序列重復(fù)單元長度的增加,相應(yīng)的拷貝數(shù)在減少。在1~6堿基重復(fù)類型微衛(wèi)星序列的變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析中,二堿基重復(fù)類型微衛(wèi)星序列的變異系數(shù)最大,為0.51。同時(shí),本論文對不同重復(fù)單元微衛(wèi)星中的AT含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)其含量與相應(yīng)微衛(wèi)星的序列總數(shù)、累積長度以及平均拷貝數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系,結(jié)果說明AT含量的增加,三者的數(shù)值均會(huì)隨著增加。3.星斑川鰈性別相關(guān)SSR標(biāo)記的篩選本研究利用分析對比得到的星斑川鰈雌性或雄性特異且重復(fù)次數(shù)大于或等于10的26對微衛(wèi)星引物掃描雌、雄各48個(gè)個(gè)體的基因組DNA,進(jìn)行第一次單個(gè)體驗(yàn)證,在雌、雄個(gè)體中擴(kuò)增出差異條帶引物只有1對。用星斑川鰈雌、雄各96個(gè)個(gè)體進(jìn)行第二次擴(kuò)大樣本個(gè)體驗(yàn)證。結(jié)果顯示:引物RAD_PE_through_237042在第二次個(gè)體驗(yàn)證中擴(kuò)增出的差異條帶的出現(xiàn)頻率在雌、雄個(gè)體中具有極顯著差異(p㩳0.01),差異等位基因片段在96個(gè)雌性個(gè)體中出現(xiàn)了29次,頻率較高,為30.21%;在96個(gè)雄性個(gè)體中出現(xiàn)了11次,頻率較低,為11.46%。對目的條帶切膠回收、克隆和測序后,通過DNASTAR分析比對,發(fā)現(xiàn)差異片段比無差異片段少了一個(gè)AT重復(fù)。由此可知,引物RAD_PE_through_237042的差異片段對星斑川鰈的性別具雌性偏好性,該位點(diǎn)應(yīng)該與星斑川鰈性別決定區(qū)域存在一定關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 2-1 部分樣本的 DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 DNAagarose gel electrophoresis results of some samplesM：DL2000 DNAMarker；1-9：9 個(gè)不同的鰭條樣品提取的基因組 DNAM: DL2000 DNAMarker; 1-9: the genomic DNAwas extracted from nine different ray samples2.2.2 微衛(wèi)星擴(kuò)增圖譜利用選擇合成的 50 對微衛(wèi)星引物對 4 個(gè)半同胞家系群體進(jìn)行多態(tài)性檢測，其中 22 對引物具有多態(tài)性。其中引物 scaffold0794994 在 4 個(gè)半同胞家系群體中的擴(kuò)增結(jié)果見圖 2-2。從電泳圖可以看出，相同引物偽雄魚個(gè)體擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性高于真雄魚。

圖 2-1 部分樣本的 DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 DNAagarose gel electrophoresis results of some samplesM：DL2000 DNAMarker；1-9：9 個(gè)不同的鰭條樣品提取的基因組 DNAM: DL2000 DNAMarker; 1-9: the genomic DNAwas extracted from nine different ray samples2.2.2 微衛(wèi)星擴(kuò)增圖譜利用選擇合成的 50 對微衛(wèi)星引物對 4 個(gè)半同胞家系群體進(jìn)行多態(tài)性檢測，其中 22 對引物具有多態(tài)性。其中引物 scaffold0794994 在 4 個(gè)半同胞家系群體中的擴(kuò)增結(jié)果見圖 2-2。從電泳圖可以看出，相同引物偽雄魚個(gè)體擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性高于真雄魚。

圖 4-1 引物 RAD_PE_through_237042 在星斑川鰈雌雄各 48 個(gè)個(gè)體的第一次單個(gè)體驗(yàn)證。M為 Marker,48♀為 48 個(gè)雌性個(gè)體，48♂為 48 個(gè)雄性個(gè)體。白色箭頭所指樣本即為出現(xiàn)差異條帶的樣本。Fig.4-1 Amplification of RAD_PE_through_237042 in 48 individuals of males and females of.Starry flounder4.2.3 差異條帶在雌、雄個(gè)體中的擴(kuò)大驗(yàn)證將在 星斑川鰈雌、雄各 48 個(gè)個(gè) 體中擴(kuò) 增差 異顯著 的微衛(wèi)星 引物RAD_PE_through_237042 在星斑川鰈雌、雄各 96 個(gè)個(gè)體中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，通過聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 檢 測 ， 擴(kuò) 增 結(jié) 果 見 圖 4-3 。 圖 片 顯 示 引 物RAD_PE_through_237042 在 96 個(gè)雌性個(gè)體中有 29 個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出差異條帶，頻率較高為 30.21%；在 96 個(gè)雄性個(gè)體中有 11 個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出差異條帶，頻率較低為 11.46%，用 SPSS19.0 軟件對具有差異條帶的 SSR 標(biāo)記在雌、雄中出現(xiàn)的頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，得到 P 值為 0.003（小于 0.01）。由此可見，SSR 標(biāo)記RAD_PE_through_237042 的差異條帶在星斑川鰈雌、雄個(gè)體中的比例呈極顯著

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本文編號：2794965