【摘要】：柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌,是引起魚(yú)類柱形病(Columnaris disease)的病原。該菌能感染多種淡水性魚(yú)類,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,主要依靠使用化學(xué)藥物對(duì)柱形病進(jìn)行預(yù)防和治療,然而藥物的大量使用會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)品藥物殘留的食品安全問(wèn)題,以及對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的影響和耐藥菌株的出現(xiàn)等問(wèn)題。開(kāi)展柱狀黃桿菌基因工程疫苗的研究將為柱形病的防治提供新思路和更為有效的方法。細(xì)菌的外膜蛋白是細(xì)菌與宿主相互作用的界面,容易被宿主識(shí)別而引起機(jī)體的免疫反應(yīng),因此被認(rèn)為是制備抗原的良好材料。利用雙向電泳(2-DE)并結(jié)合免疫印跡的方法,在柱狀黃桿菌外膜蛋白中篩選到5個(gè)免疫原性蛋白,經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)鑒定,它們是:gliding motility lipoprotein Gld J(Gld J)、hypothetical protein FCOL_09735(fcol)、F0F1 ATP synthase subunit beta(f0f1)、lipoprotein(lip)和outer membrane efflux protein precursor(omepp)。將這5個(gè)免疫原性蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,與原核表達(dá)載體p ET28a連接,分別構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒p ET28a-gld J、p ET28a-fcol、p ET28a-lip、p ET28a-f0f1和p ET28a-omepp。然后,將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)BL21感受態(tài)細(xì)胞,并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)的蛋白。將純化后的蛋白免疫草魚(yú),草魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生了特異性的抗體,而且一些免疫相關(guān)基因的表達(dá)也有上調(diào),這些基因包括Interleukin 1β(IL-1β)、IL-8和IL-10,IFN-I和IFN-γ、Immunoglobulin M(Ig M)、Ig D、Ig Z、Major histocompatibility complex I(MHC Iα)和MHC IIβ、C-reactive protein(CRP)。這5個(gè)重組蛋白,rgld J、rfcol、rf0f1、rlip和romepp對(duì)用柱狀黃桿菌攻毒后草魚(yú)的免疫保護(hù)率依次為72%、8%、32%、64%和68%。且rgld J、rlip和romepp蛋白免疫組的草魚(yú)血清對(duì)柱狀黃桿菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這3個(gè)基因是柱狀黃桿菌的保護(hù)性抗原基因,可以作為制備柱狀黃桿菌基因工程疫苗的候選抗原。另一方面,毒力因子被認(rèn)為是很好的疫苗候選基因。為了提高免疫原性和增強(qiáng)保護(hù)效果,將柱狀黃桿菌的5個(gè)可能的毒力因子基因,鋅蛋白酶、脯氨酸寡肽酶、嗜熱蛋白酶、膠原酶和硫酸軟骨素AC裂解酶的抗原片段進(jìn)行融合,構(gòu)建了它們的融合復(fù)合體的原核表達(dá)質(zhì)粒p ET32a-zptcc,并表達(dá)了相應(yīng)的融合蛋白。將純化后的融合蛋白免疫草魚(yú),發(fā)現(xiàn)草魚(yú)血清中出現(xiàn)了特異性抗體,且免疫后草魚(yú)血清中IL-1β、IL-8、IL-10、Ig M、IFN-I、CRP和MHC Iα等基因出現(xiàn)顯著上調(diào),而且該融合蛋白對(duì)用柱狀黃桿菌攻毒后草魚(yú)的免疫保護(hù)率為39%,說(shuō)明該融合蛋白有一定的免疫保護(hù)效果。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S941.4
【圖文】：

rIgD 和 rIgZ 蛋白能與相應(yīng)的單克隆抗體反應(yīng)（圖2-1），說(shuō)明鼠抗草魚(yú) rIgM，rIgD 和 rIgZ 蛋白單克隆抗體是有效的。2.3.2 柱狀黃桿菌外膜蛋白雙向凝膠電泳圖譜用 PDquest 軟件對(duì)柱狀黃桿菌外膜蛋白的雙向電泳圖片分析結(jié)果表明，共有 196個(gè)蛋白被成功分離（圖 2-2A）。蛋白點(diǎn)主要集中在酸性端。根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì) Marker，可以判斷分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的分子量基本處于 25 kDa-130 kDa 之間。2.3.3 柱狀黃桿菌外膜蛋白中免疫原性蛋白的篩選和鑒定利用免疫印跡的方法，在柱狀黃桿菌外膜蛋白雙向電泳凝膠中篩選到 7 個(gè)免疫原性蛋白點(diǎn)，經(jīng)鑒定為 5 種不同的蛋白（表 2-3）。分別為 gliding motility lipoproteinGldJ（GldJ），hypothetical protein FCOL_09735（fcol）

圖 2-2 柱狀黃桿菌外膜蛋白雙向電泳圖譜和相應(yīng)的 Western-blot 分析Figure 2-2 Out member proteins (OMPs) of Flavobacterium columnare G4separated on2-dimensional electrophoresis (2-DE) gels and recognized by grass carp antibacterial sera andanti-grass carp-Ig monoclonal antibodies.（A）柱狀黃桿菌外膜蛋白雙向電泳圖譜；（B）被草魚(yú) IgM 所識(shí)別的免疫原性蛋白；（C）被草魚(yú) IgD 所識(shí)別

圖 3-1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET28a-gldJ, pET28a-fcol, pET28a-lip, pET28a-f0f1 和 pET28a-omepp 的構(gòu)建示意圖Figure 3-1 Schematic representation of therecombinant porkaryotic expression plasmid pET28a-gldJ,pET28a-fcol, pET28a-lip, pET28a-f0f1 and pET28a-omepp

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本文編號(hào)：2789471