【摘要】：高能量密度(高脂或高糖)飼料、不平衡的營養(yǎng)元素組成以及水體金屬含量等眾多問題均能夠引起養(yǎng)殖魚類的脂肪過度積累。脂肪的過度積累不僅能降低魚的生長和飼料效率,同時也能降低魚的免疫力、抗應(yīng)激能力并引起能量代謝紊亂�，F(xiàn)階段羅非魚(Oreochromis niloticus)養(yǎng)殖過程中存在相同的問題。脂肪水解(lipolysis)是細(xì)胞中甘油三酯逐步水解產(chǎn)生脂肪酸和甘油供能的過程,在哺乳動物相關(guān)研究中,常針對該生理過程設(shè)計藥物、營養(yǎng)添加劑等以緩解肥胖和超重。但是,現(xiàn)階段魚類脂肪水解,尤其是其調(diào)控機(jī)制以及生產(chǎn)上降低脂肪過度積累,促進(jìn)脂肪利用的營養(yǎng)調(diào)控研究仍然較少。為了研究羅非魚脂肪水解調(diào)控機(jī)制并探索其在生產(chǎn)上降低魚體脂肪過度積累,促進(jìn)脂肪利用,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和營養(yǎng)學(xué)等技術(shù)手段,通過篩選不同的促脂肪水解藥物,研究了其調(diào)控羅非魚脂肪水解機(jī)制;同時,探討了2種促脂肪水解添加劑在羅非魚活體中對緩解脂肪積累、提高蛋白效率的應(yīng)用效果和機(jī)制。本研究結(jié)果可以為今后羅非魚脂肪水解機(jī)制以及緩解羅非魚脂肪過度積累的營養(yǎng)調(diào)控研究提供參考。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和結(jié)論如下:1.羅非魚甘油三酯脂酶的表達(dá)特征甘油三酯脂酶(ATGL)是脂肪水解第一步的限速酶。哺乳動物中,許多促脂肪水解藥物均能通過調(diào)控ATGL的活性來達(dá)到緩解肥胖,控制體重的目的,而魚類ATGL,尤其是羅非魚ATGL的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)特征研究較少,為了研究羅非魚脂肪水解的特征和機(jī)制,從而進(jìn)一步探討如何緩解羅非魚脂肪過度積累,促進(jìn)脂肪利用,本實(shí)驗(yàn)首先克隆了羅非魚ATGL的基因全長,其ORF長度為1539 bp,編碼512個氨基酸的多肽,蛋白質(zhì)理論分子量為56.96 k Da,等電點(diǎn)為5.81,主要定位于于細(xì)胞質(zhì)中;分析其功能域,發(fā)現(xiàn)ATGL屬于Patatin-like phospholipase domain-containing protein(PNPLA)家族,其Patatin-like phospholipase功能域在1-250氨基酸;對其基因組成進(jìn)行在線比對,ATGL與大黃魚的相似度最高,達(dá)78%,其次是青龍斑(76%),與半滑舌鰨、大彈涂魚、鯉魚及巴沙魚的相似性均接近70%,與蝦虎魚相似度最低為54%。組織表達(dá)分析表明,羅非魚ATGL在肝臟和脂肪組織中表達(dá)量最高,其次是腎臟、大腦、心臟、紅肌、脾臟以及頭腎組織,表達(dá)量最低的為鰓。同時,采用饑餓的處理方式促進(jìn)羅非魚脂肪水解以研究ATGL在脂肪水解中的表達(dá)特征。結(jié)果表明,饑餓第一天,羅非魚肝臟、肌肉及脂肪組織的ATGL表達(dá)量均顯著上升,其中,肝臟中ATGL表達(dá)量高達(dá)對照組的15倍。隨著饑餓時間的增加,肌肉中ATGL表達(dá)量逐漸下降,到第五天時,下降為最低。肝臟組織中,饑餓第三天則下降至對照水平,隨即保持不變。脂肪組織在整個饑餓周期中,均保持較高的表達(dá)水平。該結(jié)果表明,脂肪組織中的ATGL對饑餓引起的脂肪水解十分敏感,為后續(xù)篩選促脂肪水解藥物,促進(jìn)羅非魚脂肪組織脂肪水解提供了理論基礎(chǔ)。2.羅非魚脂肪和肝臟原代細(xì)胞分離方法優(yōu)化及促脂肪水解藥物篩選細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有操作方便,均質(zhì)性較好并能夠直接暴露于藥物并進(jìn)行觀察等優(yōu)點(diǎn),因此成為生理功能研究的重要技術(shù)之一。為了進(jìn)一步研究羅非魚脂肪水解的調(diào)控機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用羅非魚原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)并篩選出工具藥物。本實(shí)驗(yàn)首先參考了其他魚類原代細(xì)胞分離方法,結(jié)合羅非魚生理狀態(tài),對其分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示,羅非魚的原代細(xì)胞分離需要在羅非魚適應(yīng)溫度28℃條件下進(jìn)行,且離心條件應(yīng)該為常溫400g;當(dāng)獲取到羅非魚原代肝臟和脂肪細(xì)胞后,選用多種哺乳動物中常用的促脂肪水解藥物對羅非魚原代細(xì)胞進(jìn)行處理,結(jié)果顯示促甲狀腺素和異丙腎上腺素在羅非魚原代細(xì)胞中不能促進(jìn)脂肪水解,甚至具有抑制作用,而毛喉素能夠顯著上調(diào)羅非魚肝臟和脂肪原代細(xì)胞的脂肪水解,并具有時間效應(yīng),因此選用毛喉素作為研究羅非魚脂肪水解調(diào)控的工具藥物。在確定工具藥物后,為了進(jìn)一步研究在脂肪水解水平上調(diào)的條件下羅非魚原代細(xì)胞脂質(zhì)成分和含量,選取了薄層層析色譜法(TLC)對羅非魚原代細(xì)胞進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)首先對TLC的展層溶劑進(jìn)行了篩選,結(jié)果顯示選用庚烷:乙醚:醋酸=55:45:1時,TG、sn1,2/1,3-甘油二酯(Diglyceride,DG)、及油酸(Oil acid,OA)標(biāo)準(zhǔn)品展層效果最為清晰,因此選用該配比作為后續(xù)TLC實(shí)驗(yàn)的展層溶劑;利用TG標(biāo)準(zhǔn)品及其碘染后的吸光值構(gòu)建線性方程,線性關(guān)系為濃度=0.0023*吸光值-3.2534,R~2=0.9988,說明TLC方法可以定量分析樣品TG,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)基礎(chǔ);使用TLC分析毛喉素刺激后的羅非魚肝臟和脂肪細(xì)胞,結(jié)果顯示,其TG含量顯著降低,同時DG顯著積累,提示DG在羅非魚調(diào)控脂肪水解過程中占有重要作用。3.毛喉素對促進(jìn)羅非魚脂肪水解和脂肪利用的影響之前的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了羅非魚肝臟和脂肪原代細(xì)胞分離方法并篩選出毛喉素作為促脂肪水解藥物,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了毛喉素對羅非魚肝臟和脂肪原代細(xì)胞脂肪水解調(diào)控。首先利用不同濃度的毛喉素(0,50μM,100μM)對毛喉素的應(yīng)用濃度進(jìn)行了篩選,結(jié)果顯示50μM能上調(diào)2種原代細(xì)胞游離脂肪酸和甘油釋放,并且降低細(xì)胞TG含量,因此選擇50μM位后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最適濃度�；虮磉_(dá)結(jié)果顯示,毛喉素能夠顯著上調(diào)甘油三酯脂酶(ATGL)和蛋白激酶A(PKA)的基因表達(dá),同時β氧化相關(guān)基因過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)以及肉堿棕櫚酸�；D(zhuǎn)移酶1(CPT1),因此說明毛喉素能夠上調(diào)脂肪水解酶和脂肪酸氧化。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了毛喉素對降低羅非魚活體脂肪積累,促進(jìn)脂肪利用的影響,結(jié)果表明,毛喉素雖然不影響構(gòu)羅非魚肥胖模型的生長率及全魚和肌肉粗蛋白,但能顯著降低羅非魚飼料系數(shù),同時下調(diào)了羅非魚的肝體比和脂體比。此外,口服0.5及1.5mg/kg魚體重的毛喉素能夠顯著降低全魚和肝臟粗脂肪,并能減少肝臟和脂肪組織中的脂肪空泡,說明口服毛喉素能夠降低羅非魚活體脂肪積累,促進(jìn)脂肪利用�；蚪Y(jié)果顯示,口服毛喉素的羅非魚其ATGL,敏感激素脂酶(HSL)、甘油一酯脂酶(MGL)以及PKA基因表達(dá)顯著上調(diào),同時,β氧化相關(guān)基因,PPARα,脂肪酸結(jié)合蛋白1(FABP1)、CPT1以及乙酰輔酶A氧化酶(ACO)也有顯著上調(diào),說明口服毛喉素通過上調(diào)脂肪水解和β氧化促進(jìn)脂肪利用,提示毛喉素在緩解羅非魚脂肪過度積累上的應(yīng)用前景。4.甘油二酯對促進(jìn)羅非魚脂肪水解和脂肪利用的影響對脂肪水解水平上調(diào)的肝臟和脂肪細(xì)胞脂質(zhì)成分分析的結(jié)果說明,毛喉素促進(jìn)的脂肪水解能夠引起甘油二酯(DG)的積累,說明DG可能在脂肪水解中具有重要作用。哺乳動物的相關(guān)研究證明DG能夠促進(jìn)脂肪水解,考慮到DG作為食品添加劑的安全性,DG可能更適合實(shí)際養(yǎng)殖,因此本實(shí)驗(yàn)研究了DG對羅非魚脂肪水解的調(diào)控和活體脂肪利用的影響:首先,利用DG類似物1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol(DSG),在肝臟和脂肪原代細(xì)胞上篩選了DSG促進(jìn)脂肪水解的最佳濃度和時間,其次檢測了DSG對脂肪水解和脂肪酸氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明,DG能夠顯著增加羅非魚肝臟和脂肪細(xì)胞脂肪水解并上調(diào)了其脂肪水解酶及脂肪酸代謝相關(guān)基因。利用不同濃度的DG作為脂肪源飼喂羅非魚,結(jié)果顯示DG能促進(jìn)羅非魚的生長并降低其飼料系數(shù),羅非魚肝體比和脂體比。此外DG飼喂能夠降低全魚和各組織的粗脂肪和TG含量,肝臟脂滴空泡數(shù)量也有顯著減少,說明DG能夠降低羅非魚脂肪積累�；蚪Y(jié)果顯示,DG能夠顯著上調(diào)肝臟和肌肉組織的脂肪水解酶(ATGL、HSL、MGL),脂肪酸代謝(脂肪酸合成酶FAS、脂蛋白脂酶LPL、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白SREBP、ACO、CPT1、PPARα)基因表達(dá),同時也能夠上調(diào)其蛋白代謝相關(guān)基因,說明DG能夠通過促進(jìn)脂肪水解,FA氧化和蛋白代謝來降低脂肪積累,促進(jìn)體蛋白合成。但是,高濃度的DGO展現(xiàn)出了對羅非魚生長的負(fù)面效果,表現(xiàn)為存活率的下降和應(yīng)激相關(guān)基因的上調(diào),因此DG在羅非魚的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究。綜上所述,本論文結(jié)果說明羅非魚ATGL調(diào)節(jié)了脂肪組織中的脂肪水解,并能夠被FSK和DGO上調(diào),同時FSK和DG還能顯著緩解羅非魚活體的脂肪積累,促進(jìn)蛋白合成,這為研究魚類脂肪分解的調(diào)控機(jī)制以及在生產(chǎn)上降低魚類脂肪過度積累、促進(jìn)脂肪利用、節(jié)約蛋白以及保障魚體健康具有重要參考意義。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
【圖文】：

華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文ATGL）并確定其為甘油三酯水解第一步的關(guān)鍵酶[11,12]。脂滴甘油三酯水解的過程被簡要的分為三個步驟：ATGL和HSL將甘油三酯水解為脂肪酸和甘油二酯，HSL 將甘油二酯水解為甘油一酯，MGL 則完成最后一步將甘油一酯水解為脂肪酸和甘油(圖 1-1)。由于脂滴甘油三酯水解及其調(diào)控參與了多種生理過程，因此，以 ATGL、HSL 和 MGL 及其調(diào)控機(jī)制成為脂代謝研究熱點(diǎn)之一。

PNPLA1-9[14]。ATGL 的正式命名為 PNPLA2，該脂酶進(jìn)化較為保守，廣泛分布于真核生物體內(nèi)，包括脊椎動物，非脊椎動物，植物及真菌等[15 17]。根據(jù) ATGL序列的保守性和功能域，可以將其劃分為 4 個序列區(qū)間：區(qū)間 A 是由 N 端 250個氨基酸構(gòu)成的 α/β/α 水解折疊結(jié)構(gòu)（AA1-AA250），包含了一個典型的 180 個氨基酸的 patatin 結(jié)構(gòu)域，Rydel 及 Villena 的研究認(rèn)為該區(qū)域絲氨酸 47 至天冬氨酸 166（Ser47-D166）可能是是 ATGL 的催化活性中心[17,18]，2010 年，Duncan 等的研究確認(rèn)了這兩個位點(diǎn)是甘油三酯水解的核心區(qū)域[19]。區(qū)間 C 為 89 個氨基酸組成（AA309-A391）,含有較多的疏水殘基，Kobayashi 的研究認(rèn)為區(qū)間 C 可能與 ATGL 在脂滴上的定位和相互作用有關(guān)[20]。區(qū)間 B、D 分別為 AA250-309 以及 AA391-486，目前其功能尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文用（Fatty acid binding protein 4）[34 37]；C 端結(jié)構(gòu)域（氨基酸 301-768）包含一個在許多脂酶中常見的折疊結(jié)構(gòu)，α/β 水解折疊[38,39]；第三個結(jié)構(gòu)域?qū)儆?HSL 的調(diào)節(jié)模塊，這個區(qū)域（氨基酸 521-669）位于 HSL 的催化區(qū)域并包含所有 5 個已知的磷酸化位點(diǎn)[39,40]（圖 1-3）。

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本文編號：2784107